ВМІСТ ПРОДУКТІВ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСНЕННЯ ЛІПІДІВ І АКТИВНІСТЬ ФЕРМЕНТІВ АНТИОКСИДАНТНОГО ЗАХИСТУ КРОВІ ТА КІСТКОВОГО МОЗКУ У ЩУРІВ ЗА УМОВ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО СТРЕПТОЗОТОЦИНОВОГО ДІАБЕТУ І ВВЕДЕННЯ НІКОТИНАМІДУ

Н. Біронт, В. Бурда , М. Великий

Львівський національний університет імені Івана Франка,

вул.Грушевського, 4, м.Львів, 79005 Україна

Ферментативна антиоксидантна система включає супероксидмутазу (СОД), що каталізує реакцію дисмутації О₂ в Н₂О₂, каталазу, яка розщеплює Н₂О₂, глутатіонзалежні пероксидази і трансферази, які видаляють органічні перекиси [11]. Неферментативна антиоксидантна система об¢єднує низькомолекулярні антиоксиданти клітин: глутатіон, аскорбінову кислоту, a- токоферол та ін.

Порушення координації швидкості утворення перекисних сполук і активності ферментів антиоксидантного захисту приводить до розвитку окиснювального стресу і нагромадження вільних радикалів. Вільнорадикальні процеси активуються за багатьох патологічних станів, які супроводжуються розвитком тканинної гіпоксії різної етіології [11].

Кровотворні тканини мають низку функціональних і метаболічних особливостей. Як інтенсивно проліферувальні, вони піддаються дії мутагенних і цитотоксичних чинників. Відомі випадки, коли кровотворна тканина пошкоджена внаслідок дії стресів різної природи, особливо окиснювального . У разі достатнього забезпечення киснем у них відбувається активний обмін різних форм Fe. У цих тканинах є основний пул фагоцитів, які продукують респіраторний вибух у відповідь на стимулювальний агент [2, 6 ].

Нашою метою було дослідити вміст продуктів перекисного окиснення ліпідів ( ПОЛ ) та активність ферментів антиоксидантної системи в еритроцитах і кістковому мозку щурів за умов експериментального стрептозотоцинового діабету, а також ступінь компенсації тканинної гіпоксії внаслідок введення нікотинаміду.

Дослідження проводили на щурах - самцях масою 120-150 г. Експериментальний цукровий діабет викликали внутрішньочеревним уведенням стрептозотоцину з розрахунку 7 мг на 100 г маси тварин. Розвиток діабету контролювали за рівнем глюкози, яку визначали глюкозооксидазним методом [4]. У дослідах використовували тварин через два тижні після введення стрептозотоцину з рівнем глюкози в крові 9-14 ммоль. Рівень відновленого глутатіону визначали за методом в основі якого є реакція сульфогідрильних груп з реактивом Еллмана [18]. Активність глутатіонредуктази (ГР) (Кф 1,6,4,2) визначали за зменшенням умісту NADPH [12]. Глутатіонпероксидазу (ГПО ) (Кф 1,11,1,9) визначали за методом, в основі якого - розвиток кольорової реакції внаслідок взаємодії SH-груп з реактивом Еллмана [13]. Активність ферментів в еритроцитах розраховували на 1 мг Нв, концентрацію якого визначали ціанметгемоглобіновим методом. Активність СОД (Кф 1.15.1.1.) у крові з¢ясовували методом, який грунтується на відновленні нітротетразолію супероксидними радикалами [16]. Активність каталази (Кф 1.11.1.6.) визначали методом [8]. Уміст ТБК-залежних продуктів досліджували за реакцією з тіобарбітуровою кислотою [15 ]; дієнові кон¢югати - за методом [3].

Кістковий мозок отримували з тазових кісток. Фракціонування клітин кісткового мозку проводили центрифугуванням у тришаровому градієнті густини фікол/верографін за методом Harrison і модифікації [14]. Для досліджень використовували дві фракції кісткового мозку: клітини еритроїдного ряду, клітини мієлоїдного ряду різного ступеня зрілості. Активність ферментів у кістковому мозку обчислювали на 1 мг білка, концентрацію якого визначали за Лоурі.

За умов стрептозотоцинового діабету вміст відновленого глутатіону зменшується порівнянно з нормою (табл. 1). Таке значне зниження вмісту відновленого глутатіону в еритроцитах зумовлене, очевидно, посиленим використанням його відновлювального агента, зменшенням швидкості відновлення, а також порушеннями в процесі його біосинтезу. В еритроцитах при діабеті відновлений глутатіон інтенсивно використовується на підтримку нативного стану білків, а також у процесах видалення перекису водню і гідроперекисів органічних речовин в умовах ексудативного стресу. Водночас швидкість його регенерації обмежена, оскільки відновні еквіваленти NADH/NADPH системи спрямовані на процеси відновлення тривалентного (фері-іона) заліза метгемоглобіну до двовалентного (феро-іона заліза) [9].

Останніми роками одержано експериментальне підтвердження важливої ролі активації ПОЛ у розвитку тканинної гіпоксії за умов різних патологій, зокрема при діабеті [5]. Однією із причин інтенсифікації ПОЛ у випадку порушення надходження й утилізації кисню в тканинах є зниження напруженості антиоксидантних систем клітин. Відомо, що одним із важливих компонентів антирадикального й антиперекисного захисту є СОД і каталаза. Дані досліджень СОД свідчать про зменшення її активності в крові діабетичних щурів (табл.1). Таке зменшення активності цього ферменту може бути компенсаторною реакцією, спрямованою на підтримку АОЗ у тканинах. Активність каталази в наших дослідах також незначно зменшувалась за умов стрептозотоцинового діабету порівняно з нормою (табл.1).

У випадку цукрового діабету виявлено посилення процесів ПОЛ і зниження рівня антиоксидантної системи тканин [10]. Досліджено збільшення вмісту проміжних продуктів ПОЛ – дієнових кон¢югатів в еритроцитах порівняно з контролем та ТБК – залежних продуктів (табл. 1), що є наслідком збільшення вмісту активних кисневих молекул (АКМ) за умов інтенсифікації окисних процесів у цих клітинах при діабеті. Токсична дія продуктів ПОЛ виявляється у підвищенні частоти конформаційних змін макромолекул та ураженні мембранних структур. За літературними даними, є тісна позитивна кореляція між інтенсивністю ПОЛ і ступенем важкості діабетичних ангіопатій [11].

Такі зміни при діабеті можуть бути зумовлені модифікацією антиокиснювальних ферментів як активним киснем, так і глюкозою. Відомо, що від умісту глюкози в крові залежить ступінь неферментативного глікозилювання білків, яке приводить до їхньої ковалентної модифікації і зміни структурно-функціональних особливостей. Нагромадження в клітинах активних форм кисню при цукровому діабеті викликає окиснювальну модифікацію білків унаслідок окиснення залишків сірковмісних амінокислот ( гістидину, триптофану тирозину) і зміну координаційної геометрії металів в активних центрах [5]. Глікозилювання посилює процес окиснювальної модифікації білків-ферментів.

Унаслідок структурно-морфологічних особливостей будови еритроцитів метаболічна активність цих клітин значно детерміновано рівнем метаболізму їхніх попередників - клітин еритроїдного ряду кісткового мозку тварин. Кістковий мозок - це гетерогенна система, де одночасно функціонують клітини різних типів, які перебувають на різних рівнях проліферації і диференціації і по- різному реагують на окиснювальний стрес. Згідно з літературними даними, найчутливішими є клітини еритроїдного і мієлоїдного рядів [7]. Тому досліди проводили на розділеному кістковому мозку в градієнті густини суміші фікол/верографін на дві фракції (еритроїдну і мієлоїдну). В лізатах клітин кісткового мозку досліджували активність ферментів антиоксидантного захисту і вміст продуктів ПОЛ.

Дослідженнями виявлено, що активність ферментів кісткового мозку значно вища порівняно з такими в еритроцитах за умов стрептозотоцинового діабету (табл.2). Активність ГР у кістковому мозку збільшується, водночас активність ГПО майже не змінюється, а процеси ПОЛ посилюються. Про це свідчить збільшення рівня ТБК залежних продуктів і дієнових кон¢югатів як в еритроїдній, так і в мієлоїдній фракціях кісткового мозку за умов стрептозотоцинового діабету. З огляду на це, очевидно, що в захисті тканини від окиснювального пошкодження першочергове значення мають системи низькомолекулярних антиоксидантів з високим відновним потенціалом глутатіону й аскорбінової кислоти, а також продуктів азотистого обміну, які виявляють антирадикальну активність. Отже, кровотворні тканини, очевидно, відіграють головну роль в оперативній зміні антиоксидантного статусу організму у випадку окиснювального стресу через низькомолекулярні протектори.

Серед клітин еритроїдного ряду найвисщий рівень відновленого глутатіону виявлено у ретикулоцитах, швидкість його відновлення в цих клітинах у 6-20 разів більша, ніж у зрілих еритроцитах [6,7]. Відновлення глутатіону відбувається за участю ферменту глутатіонредуктази з використанням NADPH, і в основному залежить від активності пентозофосфатного циклу. В кістковому мозку ссавців наявні всі ферменти глутатіонового циклу. Роль GSH не обмежується формуванням основного низькомолекулярного антиоксидантного потенціалу еритроцитів і кровотворних клітин, що дає змогу протистояти гемоглобін-ферментозалежній генерації АФК. Окрім цього, клітинний GSH бере участь у підтримці пулу відновленого аскорбату-антиоксиданту, який захищає елементи системи крові зовні [6].

З метою оцінки ступеня компенсації антиоксидантної системи при діабеті щурам з вираженою гіперглікемією протягом двох тижнів уводили нікотинамід дозою 200 мг на 1кг маси тварин. Отримані результати свідчать про зниження інтенсивності вільнорадикальних процесів під впливом нікотинаміду при діабеті. Введення нікотинаміду спричиняє нормалізацію активності досліджуваних ферментів і продуктів ПОЛ в еритроцитах і кістковому мозку щурів (див. табл.1,2). Наприклад, у наших дослідах уміст відновленого глутатіону в еритроцитах щурів після введення нікотинаміду наближався до норми .

Уведення нікотинаміду гальмує швидкість нагромадження токсичних продуктів ПОЛ, нормалізує активність СОД і каталази в еритроцитах, що обмежує вільнорадикальні реакції мембранних фосфоліпідів (див..табл.1). У кістковому мозку внаслідок уведення нікотинаміду активність ГР в еритроїдній фракції збільшується, активність ГПО майже не змінюється, в мієлоїдній фракції активність ГР і ГПО зменшується. Активність ферментів антиоксидантного захисту (СОД, каталаза) і вміст ПОЛ наближались до норми (табл.2)

Нікотинамід, як попередник біосинтезу нікотинамідних коферментів викликає збільшення рівня окиснених форм і менш виражене - відновлених форм. Збільшення співвідношення NAD/NADH і NADP/NADPH зумовлює зміну активності ключових окисно-відновних ферментів і прискорення перебігу головних метаболічних процесів [1].

Таблиця 1

Вміст продуктів ПОЛ і активність ферментів антиоксидантного захисту у крові щурів за умов стрептозотоцинового діабету і введення нікотинаміду; М±m, n=5-10

Варіанти	Контроль	Діабет	Д +Намід
GSН,моль/мг Нв	4,73±0,1	1,47±0,08*	4,8±0,07
СОД ум.од./мл еритр.	2,27±0,34	1,5±0,35	1,47±0,23
Каталаза мкмоль /хв 1мг Нв	2,4±0,17	2,2±0,76	2,5±0,17
ТБК продукти мкмоль/ л плазми	67,66±18,5	124,29±11,71*	68,8±7,55**
Дієнові кон'югати, Д233 /мл еритр.	2,24±0,35	4,1±0,69*	2,15±0,23**

-* Різниця вірогідна порівняно з контролем р< 0,05

**Різниця вірогідна порівняно з діабетом р< 0,05

Обговорюють декілька можливих механізмів корегувальної дії нікотинаміду у випадку інсулінзалежного діабету у людей та експериментального стрептозотоцин- або алоксаніндукованого діабету у щурів. Згідно з одним, головна роль у дії нікотинаміду належить циклоАДР-рибозі- метаболіту NAD, який є вторинним посередником внутрішньоклітинного вивільнення Са з ендоплазматичного ретикулуму і отже, глюкозоіндукованої секреції інсуліну b-клітинами. Виявлено, що лейкоцитарний антиген СД-38, який експресується в b-клітинах, має ADP-рибоциклазну (синтез сADPR з NAD) і сADPR –гідролазну (гідроліз сADPR до

Таблиця 2

Вміст продуктів ПОЛ і активність ферментів антиоксидантного захисту в клітинах кісткового мозку щурів за умов стрептозотоцинового діабету і введення нікотинаміду; М±m, n=5-10

Варіанти	Контроль		Діабет		Д +Намід
	Еритр.. фр.	Мієл. .фр.	Еритр. .фр.	Мієл. .фр.	Еритр. .фр.	Мієл. .фр.
Гр, нмоль NADPH/хв1мг білка	55,49±7,8	68,90±4,9	88,54±7,8	91,60±5,3*	99,6±7,7	60,59±4,4**
ГПО, мкмоль GSH/хв 1мг білка	10,02±0,4	8,47±0,5	10,63±0,6	10,19±0,3	7,11±1,36	5,74±0,45**
СОД, ,ум.овні од./1мгбілка	10,1±1,2	13,2±1,2	6,47±0,8*	9,5±0,9	5,1±0,4	5,3±0,5
Каталаза, мкмоль/хв1мг білка	16,01±2,9	15,01±7,5	11,3±1,5	16,6±1,8	14,3±1,9	7,8±0,8
ТБК продукти, мкмоль/ 1мг білка	75,9±5,0	27,9±2,5	114,2±12,0,*	104,2±11,0	58,6±7,7**	65,3±8,2**
Дієнові кон¢югати, Д233/1мг білка	13,0±0,4	10,7±0,15	17,4±1,6	21,7±1,9*	11,0±0,8**	15,8±1,3**

* ,Різниця вірогідна порівняно з контролем, р< 0,05

**,,Різниця вірогідна порівняно з діабетом, р< 0,05

ADP-рибози) активність. Глюкозоіндуковане збільшення концентрації АТР у b- клітинах викликає інгібування гідролази, збільшення вмісту сADPR, мобілізацію Са з ендоплазматичного ретикулуму і секрецію інсуліну. Такі інгібітори полі- (АDР-рибозо-) синтетази, як нікотинамід і триамінобензамід попереджують зниження рівня NAD, підтримують глюкозоіндуковану секрецію інсуліну навіть за наявності цитоксичних агентів [17 ].

Отже, за умов стрептозотоцинового діабету виявлено активацію процесів ПОЛ і зменшення активності ферментів антирадикального захисту організму (СОД, каталази) в еритроцитах і кісковому мозку щурів.

Уведення нікотинаміду активує ферменти антиоксидантної системи і зменшує вміст продуктів перекисного окиснення. В основі ефекту нікотинаміду є збільшення біосинтезу і синтез NAD у тканинах щурів у разі стрептозотоцинового діабету.

___________________

1. Великий М.М., Обросова І.Г., Федик М.Я. Регуляція клітинного метаболізму нікотинамідними коферментами при різних типах експериментального діабету // Вісник Львів. Ун-ту. Сер.біол.. 1992. Вип.22. С.48-59.

2. Выдыборец С.В. Изменение эритроцитов при сахарном диабете //Врач.дело. 1990. №2. С.56-61.

3. Гаврилов В.Б., Мишкорудная М.И. Спектрофотометрическое определение содержания гидроперекисей липидов в пдазме крови по методу Плацера // Лаб.дело. 1983. №3. С. 33-35.

4. Гулый М.Ф., Дехтярь Р.Г., Бомах Л.В. Белки в медицине и народном хозяйстве. К. 1965. С.209-210.

5. Дубинина Е.Е., Шугалей И.В. Окислительная модификация белков // Успехи совр. биологии. 1993. Т.113. Вып.1. С.71-81.

6. Ефимов А.С., Плешанов Е.В. Некоторые итоги и перспективы развития диабетологии // Пробл. эндокринологии.. 1988. Т.34.№2.С.13-15.

7. Козлов Ю.А., Лаврова В.С. Система крови при сахарном диабете // Успехи совр.биологии. 1988. Т.105. С.505-520.

8. Королюк М.А., Иванова М.И., Майорова И.Т. Методы определения активности каталазы // Лаб.дело. 1988. №1. С.16-19.

9. Кулинский В.И., Колисниченко Л.С. Обмен глутатиона // Успехи биол. химии. 1990. Т.31. С.157-179.

10. Литвиненко Л.А. Влияние гипергликемии на состояние антиоксидантной защиты эритроцитов у детей из сахарным диабетом // Пробл. эндокринологии.. 1991. Т.37. №3. С.6-7.

11. Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К., Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окислительных процессов // Успехи совр. биологии. 1993. Т.113. С.442-455.

12. Методы биохим. исследований / Под ред. М.М.Прохоровой. Л. 1982.

13. Моин В.М. Простой и специфический метод определения активности ГПО в эритроцитах // Лаб. дело. 1986. №12. С.724.

14. Сибирная Н.А., Сухомлинов Б.Ф., Хмиль М.В Метод фракционирования клеток костного мозга в градиенте плотности смесей фикола и верографина . // Лаб.дело. 1991. №4. С.24-25.

15. Тимирбулатов Р.А.,Селезнев Е.И. Метод повышения интенсивности свободнорадикального окисления липидсодержащих компонентов крови и его диагностическое значение // Лаб. дело. 1981. №4. С.209-211.

16. Чевари С., Андял Т., Штрегер Ф. Определение антиоксидантных параметров крови и их диагностическое значение // Лаб. дело. 1991. №10. С.9-13.

17. Takasava S., Nata K. Jonekura Cyclic ADP-ribose in insulin Secretion from Pancreatic b-cells // Science. 1993.-Vol. 259. . P.370-373.

18. Thomas D.S., Berdenia L., Sidney R. Colorimetric method for determination of erithrocyte glutatione // J.Lab.Clin.Med. 1960. Vol.56. N7. P.157-161.