ВПЛИВ ХРОНІЧНОГО РЕНТГЕНІВСЬКОГО ОПРОМІНЕННЯ НА СТРУКТУРНО-ФУНКЦІОНАЛЬНУ ОРГАНІЗАЦІЮ БІЛКІВ І БІЛКОВИХ КОМПЛЕСІВ ПЛАЗМАТИЧНИХ МЕМБРАН ЕРИТРОЦИТІВ
вул.Грушевського 4, м.Львів, 79005 Україна
Структура і стабільність червоних клітин та їхня функціональна активність, як відомо, визначені насамперед складом білкових компонентів плазматичних мембран та ступенем їхньої міжмолекулярної взаємодії. Хронiчне рентгенiвське опромiнення добовою дозою 0,258 мКл/кг викликає змiни як популяцiйного складу еритроцитiв периферичної кровi щурiв, так i стабiльностi їхніх плазматичних мембран у рiзнi терміни 30 добового експерименту [7]. Перехід частини еритроцитів з нормальної дископодібної форми в різновиди ехіноцитної форми виявлено за допомогою методу сканувальної електронної мікроскопії в крові мишей , опромінених γ – променями дозою 5,4 сГр.[3]. Можливо, що виявлені порушення форми та стабільності еритроцитів під впливом малих доз радіації, спричинені змінами у співвідношенні інтегральних білків, які взаємодіють з білками цитоскелета, або беруть участь у формуванні надмолекулярних комплексів - аніонних каналів.
Тому нашою метою було дослiдження впливу тривалого рентгенiвського опромiнення добовою дозою 0,258 мКл/кг на вмiст мембранних бiлкiв еритроцитiв, які солюбілізують 0,5 % розчином тритону Х-100, а також на фізико-хімічну характеристику надмолекулярного білкового комплексу, який формує транспорт аніонів через мембрану еритроцитів у різні терміни 30-добового експерименту.
Дослiди проводили на безпородних бiлих щурах-самках масою 160-200 г. Тварин пiддавали тотальному рентгенiвському опромiненню на апаратi РУМ-11 добовою дозою 0,258 мКл/кг з такими параметрами: напруга 150 кВ, сила струму 5 мА, фiльтри Cu 0,5 та Al 1,0 мм, шкiрно-фокусна вiдстань 178 см, потужнiсть дози 0,064 мКл/хв. Периферичну кров брали на 10- , 20- та 30- ту доби експерименту. (Сумарні дози опромінення відповідно становили 2,58, 5,16, 7,74 мКл/кг). Плазматичнi мембрани еритроцитів видiляли за методом [10]. Солюбiлiзацiю бiлкiв плазматичних мембран еритроцитiв проводили із застосуванням тритону Х-100 [2]. Диск-електрофорез у 7,5% полiакриламiдному гелi за наявності 0,1% додецилсульфату натрiю виконували за методом Лемлi [2]. Ідентифікацію білкових фракцій провадили, застосовуючи маркерні білки з різною молекулярною масою та зіставляючи отримані дані з літературними [9,12,13] Активнiсть мембранної
ацетилхолiнестерази визначали за методом [11]. Мембранно-конформаційні переходи білків, які формують аніонний канал в еритроцитарній мембрані, індукували додаванням до еритроцитів ацетилхоліну [1], прояв яких реєстрували за зміною кінетики гемолізу еритроцитів [8]. Гемоліз еритроцитів у кислотному середовищі проводили згідно з методом Гітельзона і Терского [4]. Концентрацію білка визначали за методом Lowry et al. [14]. Результати досліджень опрацьовували статистично з використанням t-критерію Стьюдента.
Солюбiлiзацiя бiлкiв плазматичних мембран еритроцитiв у середовищi, що мiстить тритон Х – 100, дає змогу видiлити переважно iнтегральнi та деякі білки цитоскелета, такі як спектрин та анкірин. Одержані білки у контрольних тварин мають (див. таблицю) 12 електрофоретичних фракцiй: 1-ша і 2-га фракції (α - та β - спектрин), 3-тя і 4-та фракції (анкірин), 5-та ( білок смуги 3), 6 – 12-та (глікопротеїди).
Процентний вміст електрофоретичних фракцій білків плазматичних мембран еритроцитів в нормі та при дії малих доз тривалого рентгенівського опромінення (M±m, n=3-6 )
Номер фракції | Контроль | 10-та доба | 20-та доба | 30-та доба |
1 | 4,89 ± 0,64 | 3,37 ± 0,68 | 5,23 ± 1,73 | Сліди |
2 | 5,94 ± 1,09 | 5,99 ± 1,09 | 4,56 ± 1,21 | 7,72 ± 0,53 |
3 | 5,00 ± 0,28 | 4,70 ± 0,86 | 3,19 ± 0,13* | Сліди |
4 | 3,73 ± 0,21 | 4,03 ± 0,25 | 3,07 ± 0,22 * | 1,49 ± 0,23* |
5 | 20,73 ± 1,26 | 22,45 ± 2,26 | 16,20 ± 2,59 | 17,40 ± 0,20 |
6 | 6,08 ± 0,44 | 6,90 ± 0,36 | 6,11 ± 0,89 | 6,34 ± 0,81 |
7 | 14,23 ± 0,82 | 13,51 ± 0,57 | 12,19 ± 1,23 | 12,83 ± 0,42 |
8 | 6,35 ± 0,63 | 7,62 ± 0,96 | 7,07 ± 0,91 | 8,75 ± 0,53 |
9 | 14,35 ± 0,75 | 14,77 ± 0,85 | 14,86 ±0,86 | 14,99 ± 0,24 |
10 | 8,62 ± 0,65 | 9,45 ± 1.30 | 8,64 ± 0,16 | 8,26 ± 1,54 |
11 | 8,48 ± 1,13* | 3,08 ± 0,33 | 10,40, ±0,49 | 14,35 ±1,51* |
12 | 4,62 ± 1,04 | 3,37 ± 0,72 | 8,39 ± 0,53* | 7,99 ± 1,16* |
Відмінність порівняно з контролем достовірна; р £ 0,05
Данi таблиці свiдчать, що на 10-ту добу хронiчного експерименту дiя малих доз радiацiї викликає достовiрну змiну вмiсту лише 11-ї мiнорної бiлкової фракцiї. На 20-ту добу експерименту простежується зменшення анкірину (3-тя фракцiя) на 63% та
збiльшення (на 80%) кiлькостi низькомолекулярної 12-ї фракцiї. Крім того, на 30-ту добу опромiнення (сумарна доза 7,74 мКл/кг) на електрофореграмах спостерігаються слідові кількості бiлкiв 1-ї та 3-ї фракцiй (α -субодиниця спектрину та анкірин), а вмiст 2-ї електрофоретичної фракцiї (β-спектрин) суттєво збiльшується (на 30%, див. таблицю), на 40% зменшується відсотковий умiст 4-ї фракцiї (анкірин) та рiзко пiдвищується кiлькiсть 11-го мiнорного компонента.
Проведенi електрофоретичнi дослiдження бiлкового складу плазматичних мембран еритроцитiв свiдчать, що застосовані малі дози радіації суттєво не впливають на співвідношення інтегральних білків мембран еритроцитів. Виявлено зміни лише у вмісті 11-ї та 12-ї фракцій глікопротеїдів у різні терміни опромінення. Крім того, досліджено, що хронiчне рентгенiвське опромiнення значно впливає на співвідношення білків цитоскелета - α-спектрину та анкірину, якi не солюбiлiзуються в середовищі, що містить 0,5% тритон Х-100 на 30-ту добу опромінення.. У попереднiх дослiдженнях виявили, що на 30-ту добу хронiчного опромiнення оновлюється популяцiйний склад та пiдвищується стабiльність еритроцитiв у кислотному середовищi [7]. Ці дані дають змогу припустити, що виявлене суттєве зменшення вмісту α-спектрину та анкірину, виділених з препаратів плазматичних мембран, пов’язане не з реальним зменшенням їхнього вмісту, а з посиленням бiлок-бiлкових взаємодiй мiж iнтегральними бiлками та бiлками цитоскелета еритроцитiв, що виявляється у зменшенні їхньої солюбілізації на 30-ту добу хронічного опромінення.
Вплив іонізуючої радіації на фізико-хімічну характеристику надмолекулярного білкового комплексу, який формує транспорт аніонів через еритроцитарну мембрану, вивчали шляхом визначення активності ацетилхолінестерази, яка разом з білками смуги 3 створює цей канал [1] Кількість ацетилхолінестерази - iнтегрального бiлка становить приблизно 0,2% від сумарного вмісту білків еритроцитарних мембран. Інгібування цього ферменту надлишком ацетилхоліну спричиняє порушення функціонування аніонного каналу [1].
Проведені дослiдження виявили, що активнiсть ацетилхолінестерази в препаративно видiлених мембранах еритроцитiв у процесі хронічного ренгенівського опромінення (в опт. од./хв, мг білка) така: контроль - 0,399 ± 0.023; на 5-ту добу - 0,405 ± 0,054 ; на 10-ту добу - 0,176 ± 0,023 ; на 20-ту добу – 0,365 ± 0,022; та на 30-ту добу – 0,452 ± 0,033. Аналіз отриманих даних дозволив встановити достовiрне її зменшення на 56% тiльки на 10-ту добу опромiнення (сумарна доза 2,58 мКл/кг). За нашими попередніми даними, у цей термін аналогічного хронічного опромінення щурів спостерігається зменшення стабільностї мембран еритроцитів у кислотному середовищі [7]. Виявлена зміна структури плазматичних мембран на 10-ту добу експерименту, можливо, зумовлена їхньою кооперативною конформацiйною перебудовою внаслідок локальної надпорогової дiї малих доз радiацiї [5]. Вірогідно, що ця радіоіндукована зміна структури мембран впливає на доступність субстрату до активного центру ацетилхолінестерази у складі надмолекулярного білкового комплексу – аніонного каналу .
Відомо, що інгібування ацетилхолінестерази мембран еритроцитів надлишком субстрату викликає мембранно-конформаційний перехід, який
виявляється у зміні білок-білкових взаємодїй між іншими субодиницями (білки смуги 3) іонного каналу та генералізується по всій мембрані [1]. Досліджено, що цей мембранно-конформаційний ефект ацетилхоліну виявляється у зміні кінетики кислотного лізису еритроцитів – швидкість розпаду еритроцитів за наявності ацетилхоліну у цьому разі зменшується на 26% [8].
Швидкість лізису еритроцитів за наявності ацетилхоліну (1/t50 )в нормі та внаслідок дії малих доз рентгенівського опромінення, (мс-1 ); M ± m; n=5; така: норма – 8,3 ± 0,5; на 10– ту добу - 11,7± 1,3; на 20- ту добу – 10,5 ± 0,7; а на 30-ту добу – 8,4 ± 0,3. Отже швидкість розпаду еритроцитів на 10-ту добу експерименту за наявності ацетилхоліну зростає на 42%. На 20-ту добу експерименту вона є підвищеною порівняно з нормою і наближається до контрольних зна чень на 30-ту добу. Зростання швидкості розпаду еритроцитів за наявності ацетилхоліну на 10-ту добу хронічного експерименту свідчить про нівелювання впливу ацетилхоліну на кінетику розпаду еритроцитів, що також свідчить про можливе зменшення доступності активного центру ацетилхолінестерази у складі аніонного каналу для субстрату.
В літературі є дані про безпосередній вплив іонізуючого випромінювання дозою 0,15 Гр на функціонування мембранних систем перенесення іонів, наприклад, на Na+/H+ обмінник [6]. Ми дослідили, що іонізуюче випромінювання може безпосередньо впливати на структурну організацію білкового комплексу, який бере участь у перенесенні аніонів через мембрану еритроцитів, уже на 10-ту добу хронічного експерименту за умов сумарної дози 2,58 мКл/кг.
Отже, ми виявили двофазовий характер впливу хронічного рентгенівського опромінення на надмолекулярні структури мембран еритроцитів: на 10-ту добу експерименту (сумарна доза 2,58 мКл/кг) виявлено порушення структурної організації аніонного каналу, а на 30-ту добу (сумарна доза 7,74 мКл/кг) - посилення білок-білкових взаємодій між білками цитоскелету та інтегральними білками.
___________________
1. Волотовский И. Д., Финин В.С., Конев С.Д. Структурные перестройки в эритроцитарных мембранах, индуцированные взаимодействием с ацетилхолином, их связь с каталитическими свойствами ацетилхолинэстеразы // Биофизика.1974. Т.19. №.4.С.666-669.
2. Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. М., 1982.
3. Гендель Л . Я., Луннева О.Г., Круглякова К.Е., Федин В.А. Изменение формы эритроцитов при действии малых доз облучения // Третий съезд по радиационным исследованиям.( Москва, 14-17 окт., 1997): Тез. докл. Пущино. 1997. Т.1. С.111-112.
4. Гительзон М.И., Терсков И.А. Эритрограммы как метод клинического исследования крови. Красноярск, 1959.
5. Козлов А.А. К проблеме “малых доз“ в радиобиологии // Радиобиология, 198. Т.26. №3. С.424-426.
6. Пархоменко 8 И.М., Перишвили Г.В., Туровецкий В.Б. и др. Влияние малых доз ионизирующей радиации на внутриклеточный рН, АТФ и синтетическую активность культивируемых фибробластов хомячка // Радиобиология, 1993. Т.33. №2. С.104-109.
7. Сухомлинов Б. Ф., Трикуленко А.В., Дацюк Л.А. Влияние малых доз хронического рентгеновского облучения на гемолитическую стойкость и популяционный состав эритроцитов периферической крови //Радиобиология, 1988. Т.28. №6. C.829-831.
8. Трикуленко А.В., Пинишко У.В., Панкевич Г.Л. Кинетика кислотного лизиса эритроцитов в присутствии лигандов интегральных белков плазматических мембран // Биофизика. 1996. Т.41. №6. C.1275-1277.
9. Bennett V. The membrane skeleton of human erythrocytes and its implications for more complex cells // Ann. Rev. Biochem. 1985. Vol.54. №2. P.273-304.
10. Gomperts E.D., Metz J., Zail S.S. A red cell protein abnormality in hereditary spheromytotis // British Journal of Haematology, 1972. Vоl.23. №3. P.363-370.
11. Guilbault G.G., Kuan S.S., Tully J., Hackney D. New procedure for sensitive detection of cholinesterase separated by polyacrylamide gel electrophoresis // Anal. Biochem. 1970 . №.36. P.72-77.
12. Fairbanks G., Steck T.L., Wallach D.F.H. Electrophoretic analisys of the major polypeptides of the human erythrocytes // Biochem. 1971. Vol.10. №13. P.2606-2617.
13. Lenard J. Protein components of erythrocyte membrane from different animals species // Biochem. 1970. Vol.9. №25. P.5037-5040.
14. Lowry O.H., Rosebrought R.J., Farr A. et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J.Biol. Chem. 1951. Vol.193. №1. P.265-275.