ВПЛИВ КАРНОЗИНУ, Zn-КАРНОЗИНУ І ТАУРИНУ НА ВМІСТ ЛАКТАТУ ТА ПІРУВАТУ У МОЗКУ ЩУРІВ ЗА УМОВ ГІПОКСИЧНОГО СТРЕСУ
О.Крисько, М.Бойко, В.Коробов, О.Козак, М.Великий, А.Федорович
Львівський національний університет імені Івана Франка,
вул.Грушевського, 4, 79005 Львів Україна
e-mail: kfbh@franko.lviv.ua
Карнозин та його аналоги є перспективними природними метаболітами, на основі яких можна створювати нові лікарські засоби для застосування з метою попередження метаболічних порушень, які розвиваються під впливом різних гіпоксичних чинників [6]. З відомих властивостей карнозину (буферні, радіопротекторні антиоксидантні властивості) найважливішою є антиоксидантна активність, яка визначає більшість фармакологічних ефектів цього дипептиду [2]. Аналіз антиоксидантної здатності карнозину і його похідних виявив, що цей дипептид може бути буфером не лише pH, а й для вільнорадикальних форм кисню [2, 3, 5], надлишкове утворення яких, поряд з продукцією оксиду азоту, є ключовою ланкою в розвитку патогенетичних явищ у тканинах, зокрема у мозку, за умов дефіциту кисню.
Особливо важливою є та обставина, що антиоксидантний ефект карнозину і його похідних пов’язаний переважно з нейтралізацією гідроксил-радикалів, одним із шляхів утворення яких є дисоціація пероксинітриту внаслідок взаємодії супероксиданіон-радикала з оксидом азоту. Власне, з накопиченням гідроксильного радикала деякі автори пов’язують феномен загибелі нейронів під дією окиснювального стресу [4].
Таурин - функціонально активний ендогенний низькомолекулярний метаболіт центральної нервової системи. Останніми роками досліджено, що застосування таурину супроводжується позитивним ефектом під час патологічних станів, у генезі яких важливу роль відіграє тканинна гіпоксія. Інфаркти та гіпертрофії міокарда, серцева недостатність, ішемія мозку, а також гіпоксія, індукована інтенсивними фізичними навантаженнями і стресом супроводжуються різноманітними метаболічними порушеннями в організмі. Виявлено значне підвищення концентрації таурину в міокарді під час тривалої серцевої недостатності та гіпертонії. Є думка, що підвищення стійкості нейронів головного мозку під час гіпоксичних станів пов’язане з високим вмістом цього метаболіту в мозку [7].
Уважають, що захисна дія таурину за умов гіпоксії залежить від його здатності з його здатністю знижувати внутрішньоклітинну концентрацію іонів Cа2+ і, отже, попереджувати пошкодження тканин мозку під час гіпоксії та у відновний період [16]. Дані літератури свідчать про те, що таурин є перспективним терапевтичним засобом у разі патологій, пов’язаних з функціональним станом центральної нервової системи [10].
Ми досліджували вплив карнозину, Zn-карнозину і таурину на вміст пірувату і лактату, які є метаболічними продуктами головного енергетичного субстрату мозку - глюкози.
Експерименти проводили на білих безпородних низькорезистентних щурах-самцях масою 200-250 г, яких утримували в умовах віварію. Тварин попередньо тестували на стійкість до гострої гіпоксії підійманням на висоту 11500 м (час виживання у високорезистентної групи у 5.3 раза більший, ніж у низькорезистентної) [1]. Гіпобаричну гіпоксію моделювали в барокамері, де створювали парціальний тиск кисню 170 мм рт. ст., що відповідає висоті 11000 м над рівнем моря. Час експозиції становив 30 хв. Розчини Zn-карнозину та карнозину вводили внутрішньочеревно дозою 10 та 20 мг/кг маси тварини відповідно за 30 хв до гіпоксичного стресу. Таурин вводили внутрішньочеревно дозою 1/10 LD50 мг/кг маси тварин за 30 хв до дії гіпоксичного чинника.
Після декапітації тварин головний мозок видаляли, очищали від кровоносних судин і гомогенізували в 20 мМ TRIS-HCl буфері (рН 7,4) у співвідношенні буфер:тканина=3:1.
Кількісне визначення піровиноградної кислоти та лактату в гомогенатах мозку щурів проводили за методами Хохорста та Цока, і Лампрехта[15].
У модельних експериментах головний мозок інтактних щурів інкубували з генерованим в анаеробних умовах оксидом азоту протягом 2 год при 6°С у середовищі, що містило карнозин і Zn-карнозин у концентрації 0,15 мг/мл.
Унаслідок досліджень виявлено таке: вміст лактату в мозку тварин, які перебували в умовах гострої гіпоксичної гіпоксії, збільшується на 58% порівняно з цим показником у інтактних тварин, що узгоджується з літературними даними [8, 9]. Вміст пірувату в мозку щурів, яких піддавали гіпоксичному стресу, менший на 45% порівняно з інтактними тваринами (табл. 1).
Таблиця 1
Вміст пірувату і лактату (мкмоль на 1 г тканини) в мозку щурів за умов гіпоксичної гіпоксії та під час попереднього введення розчинів карнозину, Zn-карнозину та таурину (M±m, n=5-8)
Умови досліду | Вміст пірувату | Вміст лактату | Лактат/піруват |
Інтактні тварини | 0,59±0,020 | 1,51±0,13 | 9,5 |
Гіпоксичний стрес | 0,090±0,026* | 2,39±0,24* | 26,6 |
Гіпоксія+карнозин | 0,154±0,015** | 1,42±0,21** | 9,22 |
Гіпоксія +Zn-карнозин | 0,171±0,019** | 1,34±0,19** | 7,88 |
Гіпоксія+таурин | 0,130±0,018 | 1,58±0,13 | 12,15 |
* Зміни достовірні порівняно з інтактними тваринами; р<0,05
** Зміни достовірності щодо значень у тварин, які підлягали дії гіпоксичного чинника; p<0,05
Попереднє введення карнозину приводить до збільшення вмісту пірувату та зменшення вмісту лактату у мозку щурів порівняно з відповідними показниками у тварин, які зазнавали впливу гіпоксичного фактора. Отримані значення вмісту лактату і пірувату достовірно не відрізнялися від контрольних (табл. 1).
В організмі ссавців карнозин розпадається до b-аланіну та L-гістидину під впливом карнозинази [14]. З метою запобігання деградації дипептиду було використано стійкий до протеолізу комплекс карнозину з цинком. Використання цинку як комплексоутворювача обгрунтоване порівняно низькою токсичністю іонів Zn2+, на відміну від інших металів, а також антигіпоксичною дією цинку [12], що створює перспективи для клінічного застосування препарату Zn-карнозину [13].
Як видно з даних, наведених у табл. 1, уведення Zn-карнозину перед гіпоксичною гіпоксією приводить до збільшення вмісту пірувату та зменшення вмісту лактату в мозку щурів порівняно з гіпоксією. Отже, карнозин і більшою мірою Zn-карнозин запобігають розвитку ацидозу у головному мозку при гіпоксії. Очевидно, цей ефект реалізується через здатність карнозину зв’язувати протони, які вивільняються у процесі акумуляції аніонів лактату в умовах гіпоксії (pH-буферні властивості дипептиду) [11]. Це має важливе значення для попередження таких ефектів, які спостерігають у разі гіпоксії, як протонування пероксинітриту та утворення надзвичайно токсичного високореакційноздатного гідроксильного радикала [4].
З метою подальшого з’ясування ролі лактатдегідрогеназної реакції як джерела іонів H+ для протонування пероксинітриту (ONOO-) у мозку та можливої ролі карнозину у цьому процесі як конкурента за протони проводили експерименти in vitro, в яких інкубували головний мозок з оксидом азоту за наявності карнозину і Zn-карнозину та без дипептидів. Після інкубації у тканині визначали вміст пірувату і лактату (табл. 2).
Таблиця 2
Вплив NO на кількісний вміст пірувату і лактату (мкмоль на г тканини) у мозку щурів за наявності карнозину (M±m, n=8)
Варіанти досліду | Вміст пірувату | Вміст лактату |
Мозок не інкубований з NO | 0,148±0,017 | 1,60±0,19 |
Мозок інкубований з NO | 0,077±0,020* | 2,83±0,22* |
Мозок інкубований з NO за наявності карнозину | 0,175±0,018** | 1,52±0,12** |
Мозок інкубований з NO за наявності Zn-карнозину | 0,183±0,013** | 1,46±0,17** |
* Зміни достовірні порівняно зі значеннями досліджуваних показників у мозку, не інкубованому з NO; р<0,05
** Зміни достовірні порівняно зі значеннями досліджуваних показників у мозку, інкубованому з NO; р<0,05.
Із наведених у табл. 2 даних видно, що у процесі інкубації тканини мозку з NO вміст пірувату зменшується в 1,92 раза, а лактату збільшується в 1,77 раза порівняно з контролем. Якщо додавати у середовище інкубації карнозин, або Zn-карнозин, то вміст піровиноградної та молочної кислот наближається до контрольних значень (див. табл. 2).
Отже, в модельних експериментах виявлена здатність карнозину, а особливо його комплексу з цинком, ефективно запобігати ацидозу в головному мозку щурів, зокрема, в умовах надмірного утворення оксиду азоту при гіпоксичній гіпоксії.
Виявлені pH-буферні властивості карнозину та його комплексу з цинком пояснюються наявністю в структурі дипептиду імідазольного угруповання гістидину. Відомо, що pK карнозину становить 6,9 і є набагато вищим від pK лактату (3,85), що дає йому змогу протонувати імідазольне кільце. Так само pН-буферні властивості карнозину дають змогу йому конкурувати з пероксинітритом (pK=6,8) за іони H+, концентрація яких зростає в умовах ацидозу, і таким чином запобігати надмірному утворенню гідроксильного радикала [11].
Завдяки широкому спектру біологічних ефектів і низькій токсичності таурин належить до перспективних терапевтичних засобів низки патологічних процесів, пов’язаних з функціональним станом центральної нервової системи. Відомо, що застосування таурину за умов гіпоксії запобігає порушенню енергетичного метаболізму (особливо у мозку); нормалізує концентрацію компонентів аденілової системи і субстратів окиснення, збільшує швидкість субстратного фосфорилювання і дихання, знижує ступінь відновлення піридинових нуклеотидів [8].
Попереднє введення таурину за умов гіпоксичної гіпоксії приводить до запобігання розвитку ацидозу, оскільки пригнічується накопичення лактату у тканинах мозку, а співвідношення лактат/піруват наближається до норми (див. табл. 1). Вважають, що антигіпоксична дія таурину залежить від його здатності стимулювати Са2+-акумулювальну функцію мітохондрій, підвищувати активність кальційзалежних ферментів, запобігаючи руйнівній дії гіпоксичного чинника на тканини мозку [16]. Можливо, антигіпоксичний ефект таурину зумовлений його здатністю індукувати дисбаланс нейроактивних амінокислот і біогенних амінів у різних відділах мозку [10].
Отримані нами дані важливі для розроблення способу корекції функціональних порушень в антиоксидантній і кисневотранспортній системі за умов гіпоксичних станів організму низькомолекулярними метаболітами карнозином, Zn-карнозином і таурином.
___________________
1. Березовский В.Я. Риси індивідуальності в реакції на гіпоксію // Фізіол. журн. 1975. Т. 21. № 3. С.371-376.
2. Болдырев А.А. Карнозин: биологическая роль и возможности применения в медицине // Биохимия. 1992. Т. 51. № 9. C.1302-1310.
3. Болдырев А.А. О биологическом значении гистидинсодеращих дипептидов // Биохимия. 1986. Т. 51. № 12. С.1930-1943.
4. Болдырев А.А. Парадоксы окислительного метаболизма мозга // Биохимия. 1995. Т. 60. № 9. С.1536-1541.
5. Болдырев А.А., Дудина Е.И., Дупин А.М и др. Сравнение антиокислительной активности карнозина с использованием химических и биологических моделей // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1993. № 6. C.607-609.
6. Гуляева Н.В. Перспективы создания лекарственных препаратов на основе карнозина // Биохимия. 1992. Т. 57. № 9. C.1398-1403.
7. Маньковська І.М., Носар В.І., Назаренко А.І. та ін. Деякі механізми антигіпоксичної дії таурину // Физиол. журн. 1992. Т. 38. № 5. С.81-88.
8. Маньковська І.М., Середенко М.М., Нагнибіда Н.М. Особливості механізмів інтенсифікації перекисного окислення ліпідів у тканинах щурів при гіпоксії різного типу // Физиол. журн. 1993. Т. 39. № 4. С.25-33.
9. Механизмы развития и компенсации гемической гипоксии / Под ред.М.М.Середенко. К., 1987.
10. Нефедов Л.И., Дорошенко Е.М., Смирнов В.Ю.и др. Таурин индуцирует дисбаланс пула нейроактивных аминокислот и биогенных аминов в отделах головного мозга // Укр. биохим. журн. 1996. Т. 68. № 1. С.21-26.
11. Cкулачев В.П. Карнозин и анзерин как специализированные рН буферы - переносчики ионов водорода // Биохимия. 1992. Т. 57. № 9. C.1311-1316.
12. Тиунов Л.А., Кустов В.В. Токсикология окиси углерода. М., 1980.
13. Урюпов О.Ю., Сумина А.И. Механизм противогипоксического действия соединений цинка // Бюл. эксперим.биологии и медицины. 1985. Т.99. №5. С.578-580.
14. Lenney J.F. Specificity and distribution of mammalian carnosinase // Biochim. et Biophys. Acta. 1976. Vol.429. P.214-219.
15. Methods of enzymatic analysis // Ed.H.H.Bergmeuer. London, 1974. Vol.1-4.
16. Schurr A., Rigor B. The mechanism of neuronal resistanse and adaptation to hypoxia // FEBS Lett. 1987. Vоl. 224. N 1. P.4-8.