Індукція рентгенівським опроміненням мутабільності генів Х‑хромосоми у ліній

lozenge Drosophila melanogaster

Я. Бобак, Я. Черник

Львівський національний університет імені Івана Франка,

вул.Грушевського, 4, м.Львів, 79005 Україна

Актуальними сьогодні є дослідження генетичних наслідків забруднення навколишнього середовища фізичними і хімічними мутагенами, зокрема в умовах підвищеного фону радіації, та розробка методів їхнього прогнозування. Drosophila melanogaster, яка є тест-системою для виявлення різних типів мутацій і на якій зручно проводити генетичний аналіз, широко використовують у радіаційній генетиці. В літературі є відомості про вплив на стабільність геному D. melanogaster низки хімічних сполук та фізичних чинників [1, 3, 4], однак дані про мінливість геному при індукції рентгенівським опроміненням (РО) поодинокі і фрагментарні [2, 6]. Тому ми поставили за мету вивчити вплив радіації на стабільність геному D. melanogaster, зокрема, дослідити вплив різних доз РО на групу стабільних і нестабільних ліній D. melanogaster з різними алелями гена lozenge, спонтанний рівень мутування яких досліджений раніше [5].

Ми використовували лінії lozenge D. melanogaster – похідні від генетично нестабільної лінії lz^75V, виділеної з природної популяції Далекого Сходу [7]. Для врахування спонтанних та індукованих РО мутацій у Х‑хромосомі використовували самок зі зчепленими Х-хромосомами C(1)DX, y w f /Y, а частоту появи мутантів визначали як співвідношення мутантних самців до загальної кількості самців-потомків. Аналізували потомство першого - п’ятого поколінь. Опромінення імаго проводили на апараті РУМ 11 потужністю дози 300 Р/хв; сумарні дози становили 3, 10 та 30 Гр.

Відомо, що напівлетальна доза (LD₅₀) для D. melanogaster становить 550-700 Гр. Ми намагалися визначити ту мінімальну дозу, яка приводить до появи мутацій у досліджених ліній. У групи ліній lozenge методом індукції домінантних летальних мутацій (ДЛМ) було досліджено вплив РО сумарною дозою 30 Гр. Кожна з проаналізованих ліній у контролі мала індивідуальний рівень ДЛМ, який зазнавав статистично достовірного зростання в F₁ після опромінення (табл. 1). Кореляції між рівнем нестабільності ліній, алельним станом гена lozenge та рівнем ДЛМ не було виявлено. Отримані дані свідчать, що використана в експерименті доза РО є мутагенною для цієї групи ліній D. melanogaster.

Таблиця 1

Рівень домінантних летальних мутацій у ліній lozenge, %

Лінія	Контроль	РО, 30 Гр	t
lz^+2L y ct lz^+7L y cy lz^sl.2L lz^75V.1L y lz^75V.1L lz^ex.1L	1.28 0.50 0.81 0.48 0.35 0.56	2.64 2.22 3.84 1.58 2.32 1.55	6.70^* 11.74^* 13.10^* 8.54^* 12.83^* 5.80^*

t^* при p³0.95

Власне доза 30 Гр була використана у процесі дослідження частоти виникнення та спектра індукованих РО мутантів у ліній lozenge (табл. 2). Результати

свідчили про те, що, як і в контролі (під час визначення спонтанного рівня мутування), генетично стабільними були лінії з алелями lz⁺ та lz^ex; зафіксовані поодинокі мутаційні події відбувалися за межами локусу lozenge, а їхня кількість статистично не відрізнялася від даних у контролі. У генетично нестабільних ліній з алелями lz^sl та lz^75V частота мутування після дії РО достовірно збільшувалася у всіх випадках. Звернули на себе увагу розширення та певна зміна спектра алелів lz, які виникли de novo і становили основну масу мутантів, а також мутації в інших генах - yellow, white, carmine, rou; у контролі в більшості ліній вони не зафіксовані. Однак опромінення дозою 30 Гр не призводило до зміни частоти виникнення соматичних мозаїків у дослідженої групи ліній; їхня кількість і спектр не залежали від алельного стану гена lozenge. Винятком була лише лінія lz^75V.1L, у якої кількість соматичних мозаїків за генами lz, w та rou достовірно перевищувала дані контролю (табл. 2).

З метою дослідження взаємозв’язку мутування гена lz та інших генетично нестабільних локусів Х-хромосоми під час наступних експериментів у дистальну частину Х-хромосоми лінії lz^75V.1L шляхом рекомбінації введено ділянки хромосом нестабільних ліній sn^ex lz⁺ та y² w^a4 (рис.1). Синтезовані лінії sn^ex lz^75V.1L та y² w^a4 sn^+3L lz^75V.1L у Х-хромосомі містили два або чотири генетично нестабільні алелі з інсерціями різних мобільних генетичних елементів (МГЕ): yellow - з мдг4, white – з соріа (bell), singed – з мдг3, lozenge ‑ з Р-елементом.

У лінії sn^ex lz^75V.1L опромінення дозою 30Гр зумовлювало збільшення кількості мутантів уже в F₁; у F₂ та F₃ цей показник достовірно перевищував дані контролю; найвищий рівень мутабільності виявлений у локусі lozenge (табл. 3). Подібна динаміка зростання кількості мутантів простежувалась й у випаду зниження дози опромінення до 3 Гр, хоча спектр виявлених мутацій дещо звузився. Доза 30 Гр індукувала також виникнення соматичних мозаїків у F₂ та F₃ (мутації в генах white, singed, lozenge). Отже, як і у випадку вихідної лінії lz^75V.1L, опромінення приводило до збільшення кількості мутантів, розширення спектра алелів lz, виникнення мутацій в інших генах (sn, cm, w) та до зростання кількості мутацій у соматичних клітинах. Результати експерименту свідчили про те, що продовжена нестабільність цієї лінії індукувалася дозами 3 та 30 Гр, хоча ширший спектр мутаційних подій спостерігався, якщо використовували сумарну дозу 30 Гр.

Після опромінення мух лінії cm^1L sn^+3L lz^75V.1L дозою 30 Гр виявлено збільшення частоти появи мутантів уже в F₁, однак лише в F₄ та F₅ ці показники достовірно перевищували контроль (табл. 4). Статистично достовірне збільшення кількості мозаїків спостерігали лише в F₁ після опромінення; у F₂ їxня кількість зменшилась до показника контролю і зберігалась на цьому рівні в наступних поколіннях. Мутації в соматичних клітинах у більшості випадків призводили до виникнення мозаїків з алелем sn^ex і значно рідше - з алелями lz⁺ та sn^f. Зменшення дози опромінення до 10 Гр не приводило до достовірного порівняно з контролем збільшення кількості генеративних мутантів ; однак ця доза стимулювала ріст

Рис. 1. Схема одержання ліній з генетичними маркерами Х‑хромосоми.

Таблиця 2

Частота виникнення мутантів у ліній з різним алельним станом гена lozenge під впливом РО дозою 30 Гр

Лінія	Кількість самців	Мутанти				Соматичні мозаїки
		фенотип	∑	%	t	фенотип	∑	%	t
lz^+2L	5404	rou	1	0.019	0.229	w, rou, cm	12	0.222	1.729
y ct lz^+7L	14093		0				0
y ct lz^sl.2L	4545	lz^75V, lz^+, lz^ex,w^a, cm	28	0.616	5.071^*	w	1	0.022	1.504
lz^sl.1Lv f	2190	lz^+, lz^75V, rou	8	0.365	2.070^*		0		-1.096
lz^75Vv f	1736	lz^+, lz^ss, lz^ex, w	36	2.074	2.824^*	lz^+, lz^ss	3	0.173	0.493
lz^75V.1L	4602	lz^+, lz^sl, lz^B, lz^ss, lz^ex, y^1, w, cm	48	1.043	4.314^*	lz^ss, w^a, rou	4	0.087	3.987^*
y lz^75V.1L	8154	lz^sl, lz^ss, lz^ex, lz^+, w	31	0.380	5.309^*	lz^ss	1	0.012	0.374
lz^ex.1L	2484	w^a	1	0.040	1.404		0
y lz^ex.1L	2537		0				0

t - порівняння з даними контролю [1, 6], t^* при p³0.95

Таблиця 3

Частота виникнення мутантів у лінії sn^ex lz^75V.1L після дії РО

Тип досліду		Кількість самців	М у т а н т и				М о з а ї к и
			фенотип	∑	%	t	фенотип	∑	%	t
Контроль		2080	lz^+, lz^sl, sn^+	10	0.481			0
3 Гр	F1	2114	lz^+, lz^sl, lz^ss, lz^ex	20	0.946	1.788		0
	F2	2855	lz^+, lz^sl,lz^ex	39	1.366	3.097^*		0
	F3	1430	lz^+, lz^sl, sn^+, sn^f	16	1.119	2.166^*		0
30 Гр	F1	2235	lz^+, lz^sl, lz^ex	18	0.805	1.327		0
	F2	2276	lz^+, lz^sl, lz^ss, lz^ex, sn^+, sn^f, cm	32	1.406	3.121^*	w, sn^+, lz^ss	6	0.264	2.343^*
	F3	1255	lz^+, lz^sl, sn^+, w	17	1.355	2.728^*	w, sn^+,sn^f	5	0.398	2.881^*

t^* при p³0.95

кількості соматичних мозаїків за геном singed з максимальним значенням у F₃ (табл. 4). Як спонтанні мутанти, так і мутанти, одержані в двох варіантах досліду з дією опромінення (10, 30 Гр), виникали, головно, в локусі lozenge; переважали в цьому разі реверсії до lz⁺. Високий рівень мутування спостерігали також у локусах sn та cm. Найбільша кількість мутантів за геном singed виявлена в F₁ після опромінення (10 та 30 Гр), а за геном carmine - у F₂ і наступних поколіннях (ревертанти до норми - cm⁺), причому лише після опромінення дозою 30 Гр. Звернуло на себе увагу виникнення de novo мутації fbr, яку вперше описав М.Д. Голубовський у виділеній з природної популяції Далекого Сходу вихідній X^75V‑хромосомі [7]. Саме ця лінія характеризується високим рівнем спонтанного мутування, який суттєво перевищує показники батьківських ліній lz^75V.1L та sn^ex lz^75V.1L (табл. 2, 3). Очевидно, рівень мутабільності гена lozenge у лінії cm^1L sn^+3L lz^75V.1L близький до максимального для алеля lz^75V.1L і лише в F₄ та F₅ після опромінення дозою 30 Гр він зростає до статистично достовірних значень.

У лінії sn^+1L lz^+8L опромінення дозою 30 Гр приводило до різкого збільшення відразу в F₁ кількості мутаційних переходів як за геном sn, так і за рядом локусів, які відповідають за генетичний контроль структури очей та форми щетинок (lz, rou, fbr). У F₂, F₃ і F₄ частота виникнення мутантів була більшою, ніж у контролі, однак мутаційні події спостерігалися лише в гені singed, а в F₅ відбулося зниження цього показника до рівня контролю (табл. 5). Опромінення дозою 30 Гр призвело до значного збільшення кількості соматичних мозаїків за геном sn, який спостерігали протягом усіх п’яти поколінь. З використанням дози 10 Гр виявлено достовірне збільшення частоти мутування лише в F₂ (табл. 5). Мутаційні переходи, головно, зафіксовані за геном singed. Статистично достовірне зростання кількості соматичних мозаїків відбувалося за геном sn лише в F₁- F₃. Отже, опромінення дозою 30 Гр лінії sn^+1L lz^+8L, яка містить стабільний алель lz⁺, а нестабільність якої пов’язана, головно, з мутаційними подіями в локусі singed, спричиняло різке збільшення частоти появи мутантів у F₁ і збереження високого рівня генетичної нестабільності до F₄, а опромінення дозою 3 Гр – до достовірного підвищення цього показника лише в F₂. Поява соматичних мозаїків унаслідок дії 30 Гр у цієї лінії простежувалася з високою частотою до F₅, а в разі дії 10 Гр - до F₃.

Опромінення мух лінії y² w^a4 sn^+3L lz^75V.1L РО дозою 30 Гр вже у F₁ зумовлювало статистично достовірне збільшення кількості мутантів, яке досягало свого максимуму в F₂; починаючи з F₃ відбувалося певне зменшення кількості виявлених мутантів, хоча цей показник залишався достовірно вищим, ніж у контролі (табл. 6). Якщо в контролі виявлені лише мутації в генах sn і lz, то після опромінення розширювався спектр мутацій – виявлені також алелі y¹, y⁺ та w⁺. Збільшення частоти появи соматичних мозаїків у цієї лінії спостерігали у всіх п’яти досліджених поколіннях, хоча цей показник достовірно перевищував дані контролю лише в F₁ і F₂. Спектр мутацій у соматичних клітинах порівнянно з контролем не змінювався.

Таблиця 4

Вплив РО на частоту виникнення мутантів у лінії cm^1L sn^+3L lz^75V.1L

Тип досліду		Кількість самців	М у т а н т и				М о з а ї к и
			фенотип	∑	%	t	фенотип	∑	%	t
Контроль		4155	lz^+, lz^sl, sn^f, fbr	62	1.492		sn^ex, sn^f, lz^+, lz^ex, sc	89	2.142
10 Гр	F1	2378	lz^+,lz^sl, lz^ex, sn^f	36	1.514	0.069	sn^ex	200	8.410	11.856^*
	F2	2602	lz^+, fbr	41	1.576	0.273	sn^ex	204	7.840	11.191^*
	F3	2506	lz^+, lz^sl	28	1.117	-1.284	sn^ex	290	11.572	16.095^*
	F4	2082	lz^+, lz^sl	34	1.633	0.426	sn^ex	168	8.069	11.106^*
	F5	2190	lz^+, lz^sl	26	1.187	0.987	sn^ex	186	8.493	11.812^*
30 Гр	F1	1756	lz^+,lz^sl,lz^ex,sn^ex,fbr	34	1.936	1.234	sn^ex, sn^f	54	3.075	2.196^*
	F2	3385	lz^+,lz^sl,lz^ex, cm^+	60	1.773	0.960	sn^ex,sn^f, lz^+	55	1.625	1.561
	F3	5239	lz^+, lz^sl,lz^ex, w, sn^ex, cm^+, fbr,	105	2.004	1.865	sn^ex, lz^ex	126	2.405	0.926
	F4	5026	lz^+,lz^sl, lz^ex, sn^ex,cm^+	113	2.248	2.637^*	sn^ex, lz^+, sn^exlz^+	103	2.049	0.229
	F5	3433	lz^+,lz^ex,sn^ex, sn^exlz^+, cm^+	76	2.214	2.341^*	sn^ex, sn^exlz^+	67	1.952	0.510

t^* при p³0.95

Отже РО у дозах 3, 10 та 30 Гр спричиняє збільшення кількості мутаційних подій як у генеративних, так і в соматичних клітинах ліній Drosophila melanogaster, які містять у Х‑хромосомі генетично нестабільні локуси (lozenge, singed, yellow, white) з інсерціями різних родин МГЕ (copia, мдг3, мдг4, Р). У всіх досліджених ліній частота виникнення індукованих мутантів збільшується і досягає достовірно вищих

Таблиця 5

Вплив РО на частоту виникнення мутантів у лінії sn^+1L lz^+8L

Тип досліду		Кількість самців	М у т а н т и				М о з а ї к и
			фенотип	∑	%	t	фенотип	∑	%	t
Контроль		3437	sn^ex	3	0.087		sn^ex, sn^f, sc	87	2.531
10 Гр	F1	2762	sn^ex, fbr, cm	8	0.290	1.881	sn^ex	110	3.983	3.238^*
	F2	2440	sn^ex, cm^+	8	0.328	2.102^*	sn^ex	99	4.057	3.293^*
	F3	3700	sn^ex, cm	6	0.162	0.891	sn^ex	160	4.324	4.141^*
	F4	2214		0		-1.391	sn^ex	74	3.342	1.789
	F5	2053	fbr	1	0.049	-0.512	sn^ex	52	2.533	0.004
30 Гр	F1	2272	sn^ex, lz^ex, fbr, rou	19	0.836	4.471^*	sn^ex	83	3.653	2.798^*
	F2	2494	sn^ex, sn^f	8	0.321	2.063^*	sn^ex	87	3.488	2.519^*
	F3	2749	sn^ex	9	0.327	2.133^*	sn^ex	144	5.238	5.942^*
	F4	2559	sn^ex, sn^f	12	0.469	2.926^*	sn^ex	111	4.338	4.235^*
	F5	2347	sn^ex, rou	3	0.128	0.470	sn^ex, sn^f	101	4.303	4.091^*

t^* при p³0.95

Таблиця 6

Вплив РО на частоту виникнення мутантів у лінії y² w^a4 sn^+3L z^75V.1L

Тип досліду		Кількіст самців	М у т а н т и				М о з а ї к и
			фенотип	∑	%	t	фенотип	∑	%	t
Контроль		1828	lz^+,lz^sl, sn^ex	12	0.656		sn^ex,sn^f	67	3.665
30 Гр	F1	1086	lz^+,y^1	18	1.657	2.588^*	sn^ex	63	5.801	2.700^*
	F2	1115	lz^+,sn^f,y^+	34	3.049	5.077^*	sn^ex,sn^f	60	5.381	2.222^*
	F3	1193	lz^+,lz^sl,w^+	19	1.593	2.496^*	sn^ex	59	4.946	1.721
	F4	1180	lz^+, w^+	19	1.610	2.529^*	sn^ex	60	5.085	1.890
	F5	1213	lz^+, lz^sl	17	1.401	2.070^*	sn^ex	62	5.111	1.937

t^* при p³0.95

значень цього показника, ніж у випадку спонтанного мутування, вже в F₁, зберігаючись на високому рівні протягом кількох поколінь. Підвищення сумарної дози опромінення до 30 Гр зумовлює розширення спектра мутаційних подій і тривалішу в часі дестабілізацію генів. Визначена висока локусоспецифічність виявлених de novo мутацій: основна їхня кількість виникає в локусах, які містять інсерції мобільних елементів. Отже, нестабільні локуси Drosophila є чутливішими до дії РО порівняно зі стабільними генами і можуть слугувати генетичними маркерами під час дослідженні впливу малих доз радіації.

___________________

1. Гершензон С.М., Александров Ю.Н., Шандала Т. В. и др. Локус-специфичность и нестабильность мутаций, возникших в потомстве мутантов дрозофилы, индуцированных экзогенной ДНК // Биополимеры и клетка. 1991. Т. 7. №5. С. 86-97.

2. Забанов С.А., Васильева Л.А., Ратнер В.А. Индукция транспозиций МГЕ Dm412 при помощи γ-облучения в изогенной линии Drosophila melanogaster // Генетика. 1995. Т. 31. №6. С. 798-803.

3. Максимів Д.В., Щербата Г.P., Черник Я.І. Виявлення i дослідження мутаційних змін, індукованих мітоміцином С, в стабільних лініях D. melanogaster // Цитология и генетика. 1995. Т. 39. №1. С. 62-68.

4. Ратнер В.А., Забанов С.А., Колесникова О.В., Васильева Л.А. Анализ множественных транспозиций МГЭ Dm412 в геноме дрозофилы при помощи теплового шока // Генетика. 1992. Т. 28. №3. С. 68 -86.

5. Черник Я.І., Бобак Я.П. Геномна мінливість по деяких локусах Х-хромосоми дрозофіли в умовах спонтанного і індукованого рентгенівським опроміненням мутагенезу // Вісн. Львів. ун-ту. Сер. біол. 1994. Вип. 23. С. 127-130.

6. Eeken J.C.J., Sobels F.H. The effect X-irradiation and formaldehyde treatment of spermatogonia on the reversion of an unstable, P-element insertion mutation in Drosophila melanogaster // Mutation Research. 1986. Vol. 175. N2. Р. 61-65.

7. Golubovsky M.D. Unstable lozenge and fine bristle mutation from Far East population // Drosophila Inform. Serv. 1978. Vol. 53. P. 122.