Вплив генетичного блоку цитратсинтази на метаболізм метанолу у метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha
Відділення регуляторних систем клітини Інституту біохімії ім.О.В.Палладіна
НАН України
вул.Драгоманова, 14/16, 79005 Львів, Україна
e-mail: gonchar@biochem.Lviv.ua
Згідно з загальноприйнятою схемою енергетичного обміну метилотрофних дріжджів, генерація відновних еквівалентів у формі NADH, потрібних для синтезу аденозинтрифосфату (АТР), відбувається тільки внаслідок лінійного (прямого) окиснення формальдегіду і форміату у відповідних дегідрогеназних реакціях [4, 6, 10, 14]. У цьому разі вважають, що як окиснення тріозофосфатів у гліколітичних реакціях та циклі трикарбонових кислот (ЦТК), так і гексозомонофосфатний окисний шлях, важливі лише для біосинтетичних потреб і відіграють другорядну роль в енергетичному забезпеченні метилотрофного росту.
Сибірний [1] висунув альтернативну гіпотезу про енергетичну роль циклу Кребса в метилотрофному обміні метилотрофних дріжджів. Для підтвердження цього ми виконали низку експериментів, зокрема, інгібіторний аналіз [2], генетичне конструювання [12] та визначали включення радіоактивної мітки [13].
Проте деякі чинники ускладнюють однозначне трактування отриманих експериментальних даних. Зокрема, метилотрофні дріжджі - це облігатні аероби, які не здатні забезпечити себе енергією у формі АТР шляхом зброджування глюкози, отже, є ”petitе-негативними” дріжджами, для яких навіть обмін глюкози потребує ЦТК для генерації енергії. З огляду на це виникла потреба використання інших, незалежних методичних підходів для з’ясування справжньої ролі ЦТК у метилотрофному обміні. Логічним у цьому випадку є підхід з застосуванням специфічних мутантів клітин із генетичним блоком окремих ферментів циклу Кребса. Ми реалізували цю можливість, отримавши мутант Hansenula polymorpha із повним блоком цитратсинтази - ключового ферменту ЦТК, що передує відгалуженню гліоксилатного шунта в метаболічній послідовності реакцій циклу Кребса.
Мутагенез виконували шляхом УФ-опромінення клітин дикого штаму H. polymorpha 42а (дозою, що відповідає 5 % виживанню), а селекцію глутаматзалежних клонів провадили методом реплік колоній із повного середовища (суміш 1% глюкози та 1% етанолу на синтетичному середовищі з додаванням 0,03% Glu) на середовище такого ж складу, тільки без глутамату. З виходом 2×10-5 було отримано сім глутаматзалежних клонів, причому ауксотрофний фенотип на рідкому середовищі того ж складу, що й середовище відбору (1% глюкоза + 1% етанол), був підтверджений для всіх виділених мутантів, хоча деякі штами виявляли лише умовну ауксотрофію, отож їхній глутаматзалежний фенотип залежав від типу ростового вуглецевого субстрату (табл.1). Наприклад, штам 9 виявився прототрофом на середовищі з етанолом, тоді як більшість штамів мали очікуваний фенотип, тобто росли на середовищі з глюкозою за наявності малої концентрації (2 мМ) глутамату і
Таблиця 1
Ростова активність глутаматзалежних мутантів метилотрофних дріжджів H. polymorpha, у величинах оптичної густини при 540 нм
Штам\субстрат | (Г + Е)+ | (Г + Е)- | Г+ | Г- | Е+ | Е- | М+ | М- |
C3 | 1,080 | 0,015 | 0,163 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
C4 | 6,010 | 2,530 | 3,050 | 0,119 | 0,270 | 0,108 | 0,043 | 0,023 |
C5 | 0,960 | 0 | 0,148 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
C6 | 1,330 | 0,002 | 0,403 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
C7 | 0,960 | 0 | 0,240 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
C8 | 1,200 | 0 | 1,075 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
C9 | 1,330 | 0,037 | 1,950 | 0 | 2,595 | 1,771 | 0,825 | 0,076 |
П р и м і т к а. Г - глюкоза; Е - етанол; М - метанол; індекс (+\-) означає додавання 2 мМ глутамату або, відповідно, його відсутність. Час росту - 3 доби.
Таблиця 2
Питома активність ферментів ЦТК у безклітинних екстрактах глутаматзалежних мутантів метилотрофних дріжджів H. polymorpha, вирощених у середовищі зі сумішшю 1% глюкози та 1% етанолу за наявності 2 мМ Glu, нмоль×хв-1×мг-1 білка
| Штами | |||||||||
Фермент | 42а (ди- | мутанти | ревертанти | |||||||
| кий тип) | C3 | C4 | C5 | C6 | C7 | C8 | C9 | C3-r2 | C3-rs |
ЦС | 727 | 0 | 318 | 0 | 0 | 0 | 0 | 312 | 827 | 630 |
Аконітаза | 297 | 165 | 34 | 65 | 105 | 90 | 82 | 167 | | |
NAD-ІЦДГ | 42,8 | 12,9 | 25,5 | 11,7 | 9,2 | 5,7 | 7,1 | 14,0 | | |
NADP-ІЦДГ | 15,6 | 19,3 | 10,7 | 16,3 | 34,8 | 16,5 | 17,5 | 35,8 | | |
NAD-ГДГ | 12,2 | 60,3 | 15,8 | 37,4 | 113 | 36,4 | 28,6 | 93,9 | | |
NADP-ГДГ | 76,6 | 132 | 89,7 | 121 | 91 | 109 | 195 | 68 | | |
П р и м і т к а. ЦС - цитратсинтаза; ІЦДГ - ізоцитратдегідрогеназа (NAD+- і NADР+-залежна); ГДГ – глутаматдегідрогеназа (NAD+- і NADР+-залежна).
майже не росли на незброджувальних субстратах - етанолі, метанолі, незалежно від наявності глутамінової кислоти (за винятком штаму 9).
Як виявлено з аналізу активності ферментів ЦТК у безклітинних екстрактах виділених мутантів (табл. 2), п‘ять із них повністю позбавлені цитратсинтазної активності (штами С3, С5, С6, С7 і С8). Зазначимо, що майже всі глутаматзалежні штами мають підвищену глутаматдегідрогеназну активність, можливо, як наслідок метаболічної адаптації клітин до умов відсутності цитратсинтази і необхідності використання екзогенного глутамату.
Мутантний штам H. polymorpha С3 із порушенням цитратсинтази використовували для дослідження впливу блоку ЦТК на метилотрофний обмін. Для цього клітини вирощували в середовищі зі сумішшю 1% глюкози та 1% метанолу і після метилотрофної адаптації клітин шляхом інкубації в середовищі з 1% метанолом протягом 14 год вивчали включення радіоактивної мітки в вуглекислоту та біомасу (нерозчинний у трихлороцтовій кислоті (ТХО) матеріал) у процесі інкубації індукованих мутантних клітин та клітин дикого типу за наявності міченого 14С-метанолу (табл. 3). Як видно із наведених даних, у мутанта з блоком цитратсинтази спостерігається п’ятиразове зниження інтенсивності включення мітки у вуглекислоту і приблизно того ж рівня зменшення радіоактивності ТХО-нерозчинного матеріалу біомаси, що може свідчити про різке зниження інтенсивності окисних реакцій з утворенням СО2 у мутанта. Отже, на підставі отриманих даних можна було б стверджувати, що ЦТК справді відіграє важливу роль в окисненні інтермедіатів енергетичного обміну метанолу.
Таблиця 3
Включення радіоактивної мітки із 14С-метанолу в СО2 та ТХО-нерозчинний літинний матеріал у процесі інкубації метилотрофно адаптованих клітин утантного штаму H. polymorpha С3 з повним блоком цитратсинтази порівняно зі штамом дикого типу
Радіоактивність (імпульси/ хв) за стандартних умов інкубації, М±m | |||
Матеріал\штам | 42а (дикий тип) | мутант С3 | коефіцієнт зниження, разів |
СО2 | 983±43 | 193±21 | 5,09 |
матеріал (біомаса) | 2620±130 | 580±50 | 4,52 |
П р и м і т к а. Перерахунок радіоактивності виконували для стандартних умов – 80 мг клітин за 5 хв інкубації з міченим метанолом [2].
Для контролю аналізували активність низки ферментів обміну метанолу у метилотрофно адаптованих клітин мутантного штаму С3 (табл. 4). Як з’ясувалось, мутант С3 із блоком цитратсинтази водночас має сильно знижену (приблизно у 200 разів) алкогольоксидазну активність; тоді як активність інших ферментів метилотрофного обміну - каталаза, формальдегіддегідрогеназа і форміатдегідрогеназа - зберігається на рівні штаму дикого типу. Природа такого плейотропного ефекту нам не зрозуміла, можна лише припустити його адаптаційний характер, адже в рамках нашої гіпотези про суттєвість ЦТК для метилотрофного обміну логічно передбачити доцільність адаптаційного зменшення активності алкогольоксидази (АО) за умов блокування циклічного, із залученням ЦТК, окиснення формальдегіду у дефектного за цитратсинтазою штаму. Проте з об’єктивних позицій ми не можемо не брати до уваги альтернативного пояснення, що зниження включення мітки в СО2 та біомасу зумовлене не блоком ЦТК, а зменшенням алкогольоксидазної активності мутантного штаму. Адже відомо, що завдяки низькій спорідненості АО до кисню навіть порівняно висока активність цього ферменту може лімітувати швидкість метилотрофного обміну. Наприклад, вилучення гена АОХ1 із сильнішим промотором за умови функціонування іншого гена зі слабшим промотором АОХ2 у Pichia pastoris [5], що спричинює зниження алкогольоксидазної активності у три рази (~0,16 од./мг), приводить до п’ятиразового зменшення часу генерації клітин під час росту на метанолі.
Таблиця 4
Питома активність деяких ферментів метилотрофного обміну в безклітинних екстрактах дикого, мутантного та ревертантних за цитратсинтазою
штамів H.polymorpha
| Питома активність, мкмоль×хв-1×мг-1 | |||
Фермент\штам | штам дикого типу | мутантні штами та їхні ревертанти | ||
| 42а | С3 | С3-r2 | C3-rs |
Алкогольоксидаза (АО) | 2,1 | 0,01 | 0,004 | 1,5 |
Каталаза | 1300 | 700 | | |
Формальдегід-ДГаза | 0,124 | 0,058 | | |
Форміат-ДГаза | 0,072 | 0,048 | | |
Ми спробували отримати ревертанти - прототрофи за глутаматом - із мутантного штаму С3, дефектного за цитратсинтазою. Мутагенез проводили за допомогою УФ-опромінення, а позитивну селекцію - за відновленням росту на середовищі із сумішшю 1% глюкози та 1% метанолу без додавання глутамату. Одержано два прототрофні клони - r2 i rs - із відновленою цитратсинтазною активністю (табл. 2), причому перший із них виявляв температурно-залежну ауксотрофність: ріс на глюкозному середовищі при пермісивній температурі (26оС) без глутамату, а ріст при 35ОС спостерігався лише за наявності Glu. Аналізуючи цитратсинтазну активність у безклітинних екстрактах ts-ревертанта r2, виявили, що ts-ростовий фенотип мутанта узгоджується із підвищеною термолабільністю цитратсинтази. Наприклад, у процесі інкубації безклітинних екстрактів при 450С в 10 мМ фосфатному буфері, рН 7,5 цитратсинтаза штаму r2 майже повністю інактивується за 40 хв з повним збереженням вихідної активності ферменту дикого штаму. Про зміну фізико-хімічних характеристик мутантної форми цитратсинтази свідчить і зміна рН-оптимуму дії ферменту (дані не наведено). Отримання мутанта метилотрофних дріжджів із термолабільною цитратсинтазою могло б слугувати зручною моделлю для вивчення ролі ЦТК в енергетичному обміні метанолу, адже просте прогрівання мутантних клітин було б простим інструментом модуляції клітинного рівня цитратсинтазної активності і дало б змогу вивчати кореляцію між цією активністю та рівнем включення радіоактивного вуглецю із міченого метанолу в СО2, тобто вивчати взаємозв’язок між інтенсивністю ЦТК і потоком окиснення метанолу до вуглекислоти. На жаль, як видно з табл. 4, штам С3-r2, як і вихідний мутант С3, має зменшену алкогольоксидазну активність, що ускладнює проведення таких досліджень. Інший ревертант, С3-rs, має нормальну активність АО, проте його відновлена цитратсинтаза не виявляє підвищеної термолабільності, що не дає жодних переваг отриманому ревертантові порівняно з вихідним штамом дикого типу для вивчення проблеми взаємозв’язку між циклом Кребса та енергетичним метилотрофним обміном.
Що стосується природи мутації у мутанта C3, яка приводить до втрати цитратсинтазної активності, то на підставі отримання ревертанта із термочутливою цитратсинтазою можна припускати пошкодження відповідного структурного гена у цього мутанта. Взаємозв‘язок між втратою цитратсинтазної та АО-активності у мутанта С3 незрозумілий, тим більше, що існують ревертанти із відновленою цитратсинтазною активністю і протилежними фенотипами щодо АО-активності - як із низьким рівнем синтезу цього ферменту (штам С3-r2), так і нормальною його активністю (штам C3-rs). Важко собі уявити існування у структурі цитратсинтазного білка функціонального домену, за допомогою якого, завдяки участі певного посередника, може відбуватися вплив на регуляцію синтезу АО, хоча подібні твердження в літературі вже наводили. Зокрема, є незаперечні дані про біфункціональність білка ізоформи гексокінази РІІ дріжджів, яка, крім ферментативної активності, виявляє регуляторну здатність, що залучена у процес глюкозної катаболітної репресії [7, 15]. Здатність до зв’язування з ДНК та активаторний вплив на транскрипцію спостерігали для кількох гліколітичних ферментів, зокрема для гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази [9]. Поліфункціональність ряду ферментів, зокрема ЦТК, постульована і в працях співробітників нашого відділу [3, 11], де припущено участь гексокінази у здійсненні глюкозної катаболітної репресії синтезу АО, а кетоглутаратдегідрогенази - репресії, індукованої етанолом.
Вірогідно, що є якісь інші причини взаємозв’язку між зменшенням цитратсинтазної та АО-активностей у мутанта С3. Останнім часом ведуть інтенсивні молекулярно-генетичні дослідження ферментів ЦТК у пекарських дріжджів [8] Наприклад, відклоновано і проведено функціональний аналіз двох генів, які кодують цитратсинтазу, CIT1 і CIT2, причому продукт першого гена - мітохондріальний, а продукт експресії другого - імпортується в пероксисоми. Третій ген, CIT3, виявлено у процесі секвенування ДНК за гомологією з попередніми генами, проте рівень експресії та функція його ще не з’ясовані. Сконструйовані генно-інженерні мутанти із розщепленим геном CIT1 не засвоювали ацетату і мали довгий лаг-період під час росту на інших незброджувальних субстратах, тоді як аналогічні мутанти за CIT2 не мали вираженого фенотипу. Одночасне пошкодження обох генів призводить до глутаматної ауксотрофії і щезання цитратсинтазної активності. Кількість генів, які кодують цитратсинтазу у petite-негативних облігатно аеробних метилотрофних дріжджів, не відома. Можна припустити, що в цих дріжджів є один функціонально-суттєвий ген цитратсинтази, продукт експресії якого може імпортуватись як у мітохондрії, так і в пероксисоми. Подібне характерне і для каталази: у метилотрофних дріжджів припускають існування одного гена, продукт якого є як у цитозолі, так і в пероксисомах, на відміну від пекарських дріжджів, у яких дві структурно відмінні форми каталази - Т і А - мають різну локалізацію, цитозольну і пероксисомальну, і кодуються двома різними генами, CTT1 і CTA1 відповідно. Пошкодження гена цитратсинтази в отриманого нами мутанта С3, можливо, приводить до появи в пероксисомах структурно зміненого білка, нагромадження якого може призвести до руйнування пероксисом та інактивації АО. Подібне відбувається (тільки на клітинному рівні) за серпоклітинної анемії, коли нагромадження в еритроцитах аномального гемоглобіну S прискорює руйнування цих клітин.
Отже, плейотропність змін у цитратсинтазного мутанта С3 не дає змоги однозначно трактувати порушення у нього здатності до метилотрофного росту та зменшення інтенсивності перенесення мітки із міченого метанолу у вуглекислоту, а тому в наступних експериментах плануємо проаналізувати поведінку штамів із генетичними порушеннями інших ферментів лінійного та циклічного шляхів окиснення метанолу.
___________________
1. Сибирный А.А. Некоторые аспекты регуляции метаболизма метанола у дрожжей // Биохимия животных и человека. Биотехнология 1. 1987. Вып.11. С.52-63.
2. Сибирный А.А., Гончар М.В. Влияние цитрата и диоксиацетона на окисление метанола у дрожжей Hansenula polymorpha // Укр. биохим. журн. 1990. Т.62. С.108-112.
3. Сибирный А.А., Титоренко В.И., Боневоленский С.В., Толсторуков И.И. О различиях в механизмах этанольной и глюкозной катаболитной репрессии дрожжей Pichia pinus // Генетика. 1986. Т.22. С.584-592.
4. Троценко Ю.А. Метилотрофные эукариоты // Успехи микробиологии. 1983. Т.18. С.18-38.
5. Cregg J.M., Madden K.R., Barringer K.J. et al. Functional characterization of the two alcohol oxidase genes from the yeast Pichia pastoris // Mol. Cell. Biol. 1989. Vol.9. P.1316-1323.
6. Dijken J.P. van, Veenhuis M., Harder W. Peroxisomes of methanol grown yeasts // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1982. Vol.386. P.200-216.
7. Entian K., Fröhlich K. Saccharomyces cerevisiae mutants provide evidence of hexokinase PII as a bifunctional enzyme with catalytic and regulatory domains for triggering carbon catabolite repression // J. Bacteriol. 1984. Vol.158. P.29-35.
8. McAlister-Henn L., Small W.C. Molecular genetics of yeast TCA cycle isozymes // Progr. in Nucl. Acid Res. and Mol. Biol. 1997. Vol.57. P.317-339.
9. Morgenegg G., Winkler G.C., Hübscher U. Et al. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase is a nonhistone protein and a possible activator of transcription on neurons // J. Neurochem. 1986. Vol.47. P.54-62.
10. Sahm H. Metabolism of methanol by yeasts // Adv. Biochem. Eng. 1977. Vol.6. P.77-103.
11. Sibirny A.A., Titorenko V.I., Efremov B.D., Tolstorukov I.I. Multiplicity of mechanisms of carbon catabolite repression involved in the synthesis of alcohol oxidase in the methylotrophic yeast Pichia pinus // Yeast. 1987. Vol.3. P.233-241.
12. Sibirny A.A., Ubiyvovk V.M., Gonchar M.V. et al. Reactions of direct formaldehyde oxidation to CO2 are non-essential for energy supply of yeast methylotrophic growth // Arch. Microbiol. 1990. Vol.154. P.566-575.
13. Ubiyvovk V.M., Gonchar M.V., Sibirny A.A. Pathways of energy generation during yeast methylotrophic growth // Folia Microbiol. 1994. Vol.39. P.552-553.
14. Veenhuis M., van Dijken J.P., Harder W. The significance of peroxisomes in the metabolism of one-carbon compounds in yeasts // Adv. Microbiol. Physiol. 1983. Vol.24. P.1-82.
15. Wills C. Regulation of sugar and ethanol metabolism in Saccharomyces cerevisiae // Biochemistry and Mol. Biol. 1990. Vol.25. P.245-280.