ІНДУКЦІЯ ДОМІНАНТНИХ ЛЕТАЛЬНИХ МУТАЦІЙ У DROSOPHILA MELANOGASTER ВНАСЛІДОК ДІЇ РЕНТГЕНІВСЬКОГО ОПРОМІНЕННЯ В КОМПЛЕКСІ З ДЕЯКИМИ ХІМІЧНИМИ РЕАГЕНТАМИ

Н. Кімак, Я. Черник

Львівський національний університет імені Івана Франка

вул.Грушевського, 4, 79005 Львів, Україна

Хорошим модельним еукаріотичним об^,єктом радіаційної генетики є Drosophila melanogaster, на якій можна проводити облік різних типів мутацій і виявляти характер мутаційних змін. У низці праць [3, 7, 10] досліджено, що радіоіндукована відповідь дрозофіли залежить від стадії розвитку, фізіологічної зрілості і статі імаго. Є дані про те, що самки більш радіорезистентні, ніж самці, причому відповідь на дію радіації у самок залежить від фізіологічної зрілості, досягнення якої пов’язане з посиленням репаративних процесів. Найбільш чутливими до дії радіації є ембріональні стадії; під час розвитку яєць їхня стійкість до опромінення підвищується в декілька разів. Найбільш резистентними до впливу РО є дорослі особини, які в сотні разів стійкіші від ембріонів (LD₅₀ = 550 - 750 Гр). Уважають, що висока резистентність імаго пов^,язана з підвищеним умістом у гемолімфі ендогенних речовин – амінокислот, поліпептидів, амінів, а також з особливостями трахейного дихання, яке приводить до зменшення вмісту кисню в тканинах [5 ].

У деяких працях [8, 9, 15] проаналізовано мутаційні події у дрозофіли, які виникли в результаті комплексного впливу рентгенівського опромінення (РО) і хімічних реагентів. Виявлено [9], що пошкоджувальний ефект комбінованої дії може перевищувати суму ефектів кожного із діючих факторів (синергізм), що найбільш небезпечно для об^,єкта. Наприклад, Моссе та інші [8], досліджуючи комбіновану дію нітриту натрію і нітрату натрію з РО, виявили, що хімічні сполуки значно посилюють генетичний ефект радіації. В працях Я.Бобака та ін. [1], Н. Кімак та ін. [6], Я. Черник і ін. [14, 18] досліджено дію РО в комплексі з нітрозоетилсечовиною (НЕС) і кофеїном на частоту появи видимих рецесивних мутацій у Х-хромосомі в стабільної лабораторної лінії y²w^a4.

Наша мета - проаналізувати частоту виникнення домінантних летальних мутацій (ДЛМ) у Drosophila melanogaster у процесі дії РО і комплексного впливу РО з НЕС і РО з кофеїном.

У дослідженнях використано лінії Drosophila melanogaster: дикий тип Oregon ; y²w^a4 ( лінія з морфологічними маркерами Х-хромосоми).

Опромінювали триденних самців сумарними дозами 1000 і 3000 Р. Хімічні сполуки вводили в середовище для личинкового згодовування до опромінення із розрахунку: НЕС - 2.5 мкг/мл середовища і кофеїну - 0.5 мкг/мл середовища. Оброблених самців схрещували з інтактними самками цієї ж лінії. Запліднених самок розсаджували в камери для яйцекладок по 50 особин у кожну. Тест на виявлення ДЛМ проводили згідно з Ватті [4]. Цей метод дає змогу реєструвати як генні мутації, так хромосомні аберації. Домінантні мутації виявляються як у гомозиготному, так і в гетерозиготному станах і можна з високою точністю визначити кількість мутаційних пошкоджень геному. Дрозофіл утримували в темноті при температурі 25⁰С на стандартному поживному середовищі [16].

У попередніх працях [1, 12, 13, 18] проаналізовано поодинокий вплив РО і дія радіації сумарною дозою 3000Р у комплексі з НЕС і кофеїном на частоту появи видимих мутацій у Х-хромосомі в імаго стабільної лабораторної лінії y²w^a4. Виявлено, що підвищення дози опромінення приводило до збільшення частоти появи мутантів і розширення спектра мутацій. Унаслідок одночасної дії РО і хімічних агентів сумарний ушкоджувальний ефект посилювався, а висока мутабільність локусів Х-хромосоми простежувалась протягом декількох поколінь (явище продовженої генетичної нестабільності). Переважна більшість мутантів, отриманих у різних серіях дослідів з дією РО, характеризувалася, головно, зниженими показниками середньої тривалості життя порівняно з вихідною лінією y²w^a4.

Для того, щоб створити цілісне уявлення про вплив РО на мутаційні події у дрозофіли в процесі раннього онтогенезу, використовували метод ДЛМ, який дає змогу враховувати частоту як ранньої ембріональної загибелі (РЕЗ), так і пізньої ембріональної загибелі (ПЕЗ) (див. таблицю). Як контроль використана інтактна лінія y²w^a4. Як видно із наведенихпредставлених даних, у цієї лінії показник загальної частоти виникнення ДЛМ становив 3.97% і втричі перевищував його значення лінії дикого типу Oregon (1.23%).

Під час дослідження впливу РО в дозі 1000 Р частота РЕЗ становила 8.66%, що вдвічі перевищувало показник ПЕЗ (4.92%); сумарна частота ДЛМ становила 13.58% (див. таблицю). Унаслідок дії дози 3000 Р загальний показник ДЛМ майже не відрізнявся від попереднього, проте частота РЕЗ була вищою і дорівнювала 12.8%. Одержані дані свідчать про те, що ранні стадії ембріонального розвитку дрозофіли є найбільш чутливими до підвищення дози опромінення. Частота ПЕЗ була незначною і становила 0.95%.

У наступних експериментах досліджували спільну дію РО з НЕС та кофеїном на частоту появи ДЛМ у лінії y²w^a4. Нітрозоетилсечовина, будучи алкілювальним агентом, індукує, в основному, утворення точкових мутацій (найчастіше це заміна пар основ) або внутрішньогенні перебудови, розміром до 50-100 н.п. У працях Г.Щербатої та ін. [13, 14] описано, що цей мутаген індукував протягом 40 поколінь продовжену генетичну нестабільність у Drosophila melanogaster, яка характеризувалася високою локусоспецифічністю появи мутацій; найчастіше

мутаційні переходи відбувалися в локусах yellow, scute, white, cut, singed, miniature, vermillion. Ми проводили експеримент, досліджуючи вплив НЕС на частоту виникнення ДЛМ, і виявили (див. таблицю), що НЕС спричиняла достовірне

збільшення цього показника до 19.46%. Різко зростав порівняно з контролем і показник РЕЗ (до 17.89%), хоча частота ПЕЗ дещо зменшувалась і дорівнювала 1.58%.

Щодо дії кофеїну, то в літературі є дві суперечливі думки. У переважній більшості праць антимутагенні властивості кофеїну описані в експериментах, проведених на мікроорганізмах [19, 20]. В експериментах на ембріонах курчат [3], на клітинах еукаріот [17], на імаго дрозофіли [11] виявлено підвищення ефекту тих чи інших мутагенів унаслідок додаткової дії кофеїну. Можливо, здатність кофеїну виявляти модифікувальний ефект залежить від генотипу клітини та її фізіологічного стану. Крім того, можливість втручання кофеїну в мутаційний процес залежить від дози і специфіки діючого мутагена, тобто характеру первинних пошкоджень хромосом, які виникають. На підставі аналізу загальної частоти появи ДЛМ, індукованих кофеїном, виявлено збільшення цього показникам (6.9%) (див. таблицю). Відбувалося це внаслідок зростання частоти РЕЗ (5.68%), а частота ПЕЗ залишалася, як і в контролі, незначною (1.22%). Як видно із одержаних даних, кофеїн індукував якнайнижчу частоту появи як РЕЗ, так і загальну частоту ДЛМ, тобто виявляв значно слабший пошкоджувальний ефект на ранні етапи ембріогенезу дрозофіли порівняно з такими сильними мутагенами, як РО та НЕС.

Частота виникнення ДЛМ ( %), індукованих РО в

комплексі з хімічними реагентами у лінії y²w^a4

Вид досліду		Частота		t, коефіцієнт Стюдента
	РЕЗ	ПЕЗ	ДЛМ	контроль	дослід
Oregon	-	-	1.23	-		-
Контроль	2.06	1.91	3.97	-		-
1000 Р	8.66	4.92	13.58	20.86		0.23
3000 Р	12.8	0.95	13.75	9.61
НЕС	17.89	1.58	19.46	26.16		17.22
РО + НЕС	38.79	5.23	44.03	46.67
Кофеїн	5.68	1.22	6.9	6.71		28.12
РО +кофеїн	36.34	4.77	41.11	42.02

Р≥0.95

Різко збільшувалася сумарна частота ДЛМ унаслідок сумісного впливу РО з НЕС та кофеїном (див. таблицю). Аналізуючи дані, наведені в таблиці, можемо зробити висновок, що спільна дія РО і НЕС приводила до значного зростання загального показника ДЛМ, який досягав 44.03%. Синергічний ефект спостерігали й унаслідок комплексного впливу РО і кофеїну. У цьому разі частота ДЛМ теж була високою і дорівнювала 41.11%. В обох випадках також значно зростала частота РЕЗ. Ці показники суттєво не відрізнялися між собою і становили: внаслідок сумісної дії РО і НЕС - 38.79%, а внаслідок дії РО і кофеїну – 36.34%. Частоти ПЕЗ теж зростали порівняно з контролем, досягаючи 5.23 і 4.77% відповідно.

Отже, як унаслідок збільшення дози опромінення, так і внаслідок його спільної дії з хімічними агентами (НЕС, кофеїн) сумарна частота ДЛМ збільшувалася. Таке збільшення зумовлене, головно, зростанням показника РЕЗ, що свідчить про те, що ранні стадії ембріогенезу дрозофіли є найбільш чутливими до впливів різних екстремальних факторів.

___________________

1. Бобак Я.П., Шоханов С.О., Кімак Н.Я., Черник Я.І. Індукована рентгенівським опроміненням генетична нестабільність по локусах Х-хромосоми у лабораторних ліній Drosophila melanogaster // Актуальні проблеми медицини, біології, ветеринарії і сільського господарства. 1996. Вип.2. С.78-84.

2. Брусиловский А.И. Жизнь до рождения. М., 1991. С.177-178.

3. Варенцова Е., Хромых Ю. Радиобиологические эффекты мутаций радиочувствительносты в эмбриогенезе дрозофилы // Радиобиол. съезд: Тез. докл. Пущино, 1993. Ч.1. С.166.

4. Ватти К.В., Джапаридзе Л.А. Сравнительное изучение мутабильности особей разных полов: РСПЛ и ДЛМ у Drosophila melanogaster // Генетика. 1980. №8. С.1389-1395.

5. Гершензон С. М. Мутации. К., 1991. 112 с.

6. Кімак Н.Я., Черник Я.І. Виживання та середня тривалість життя у індукованих рентгенівським опроміненням мутантних ліній Drosophila melanogaster // Актуальні проблеми медицини, біології , ветеринарії і сільського господарства. 1998. Вип.4. С.198-202.

7. Коваль О., Вайсерман А., Кошель Н., Войтенко В. Влияние облучения на разных стадиях жизни имаго на продолжительность жизни Drosophila melanogaster // Радиобиол. съезд: Тез. докл. Пущино, 1993. Ч.2. С.460.

8. Моссэ И., Плотников С., Сушко С. Исследование комбинированого действия нитратов, нитритов и ионизирующего излучения на мутационный процесс у дрозофилы и мышей // Всесоюз. симп. “Объем и методы генотоксической оценки и побочных эффектов биологически активных веществ“: Тез.докл. М., 1989. Т.1. С.67-68.

9. Романенко А., Дергачева И. Синергические эффекты комбинированного действия физических и химических агентов // III съезд по радиационных исследованиям: Тез. докл. Пущино. 1997. Т.2. С.209-210.

10. Сущенко Р., Евдокимова Е., Плеханов Р. Влияние рентгеновского облучения на плодовитость Drosophila melanogaster // Радиобиология. 1985. Т.25. №4. С.523-533.

11. Шварцман П., Сондорс З., Филиппова О. Модификация кофеином частоты индуцированных химическими мутагенами соматических мозаиков у дрозофилы // Генетика. 1980. Т.16. №6. С.299-308.

12. Шоханов С.О., Щербата Г.Р., Черник Я.И. Геномная изменчивость лабораторных линий и природных популяций Drosophila melanogaster при действии рентгеновского излучения // Генетика. 1997. Т.33. №1. С.25-30.

13. Щербата Г.Р. Кимак Н.Я., Максымив Д.В. Природа индуцированных рентгеновским облучением мутаций в системах продленной генетической нестабильности у Drosophila melanogaster // III съезд по радиационных исследованиям: Тез. докл. Пущино, 1997. Т.2. С.133.

14. Щербата Г.Р., Максимів Д.В., Черник Я.І. Індукована мобільними генетичними елементами нестабільність генів у Drosophila melanogaster // Цитология и генетика. 1999. Т.33. №1. С.54-70.

15. Abrahamson S. Radiation and chemical mutagenesis: studies in gonial cells of Drosophila // Enviren. mutagenes and carcinogenesis. Bombay. 1986. P.47-50.

16. Ashburner M. Drosophila. Cold Spring Harbor University Press. NY USA. 1989. Vol.1.

17. Boyd J., Harris P., Narachi M. Drosophila melanogaster: A model eukaryote for the study of DNA repair // Cellular responces to DNA damage. NY. Liss. 1983. P.107-123.

18. Chernik Ya., Bobak Ya., Shcherbata G. Genetic unstability of Drosophila melanogaster by complex effect of irradiation and nitrosoethylurea // 2^nd International Conference “Radiobiological Consequences of Nuclear Accidents”: Moscow, 27-28 October. 1994. P.39.

19. Clarke C.N., Shankel D.V. Antimutagenesis in microbial systems // Bacterid Revs. 1975. Vol.39. №1. P.33-53.

20. Kilhman B.A. Effects of coffeine on the genetics material // Mytat. Res. 1974. Vol.26. №2. P.53-60.