Міжродова кон'югація Escherichia coli - Streptomyces - використання для введення генетичної інформації в штами Streptomyces kanamyceticus і Streptomyces globisporus

                                       

А.Лужецький, А.Мазепа, О.Мар'їна

 

Львівський національний університет імені Івана Франка 

вул.Грушевського 4, м.Львів, 79005 Україна

e-mail: genetic@franko.lviv.ua

 

Актиноміцети - представники видів Streptomyces globisporus та Streptomyces kanamy­ceticus - останнім часом привертають щораз більшу увагу. S.globisporus 1912 є продуцентом ландоміцину Е, що належить до групи маловивчених ангуциклінових антибіотиків, які сповільнюють ріст ракових пухлин [2]. S.kanamyceticus I  - модельний штам для вивчення біосинтезу 2-дезоксистрептамінових антибіотиків, які є основою для створення нових напівсинтетичних препаратів медичного призначення з широким спектром антимікробної дії [1]. Для генетичного вивчення і генно-інженерного конструювання штамів цих мікроорганізмів  треба мати методи,  що дають змогу ефективно вводити і підтримувати сторонню ДНК у досліджуваних штамах. Нашою метою  був пошук ефективних способів уведення ДНК у штами S.globisporus 1912 і S.kanamyceticus І.

Штами S.globisporus 1912 і S.kanamyceticus 1, які були об'єктами наших досліджень, отримані з Інституту мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України та РНЦА (Москва, Росія), відповідно; штам E.coli S17-1 і плазміду pSET152  - з відділу біохімії Кембриджського університету, плазміди рIJ702 і pWHM4 - з ДНДІ генетики та селекції промислових мікроорганізмів (Москва, Росія). У роботі використовували стандартні методики виділення плазмідної ДНК з клітин E.coli [3], сумарної ДНК з клітин актиноміцетів, отримання, регенерації та трансформації протопластів стрептоміцетів [6]. ДНК-ДНК гібридизацію за Саузерном проводили згідно з методикою роботи з ДІГ-міченою ДНК [5]. Штами актиноміцетів вирощували на повноцінному вівсяному середовищі [6]. Регенерацію протопластів та селекцію трансформантів проводили на середовищі R2. Штами E.coli вирощували на середовищі LB [4].

Найпоширенішою процедурою для введення рекомбінантних ДНК у клітини видів Streptomyces є трансформація і трансфекція протопластів. Незважаючи на ефективність методів отримання і регенерації протопластів S.kanamyceticus і S.globisporus, наші спроби трансформувати ці штами виявились неуспішними. Використання традиційних плазмідних векторів (plJ702, pWHM4), маркером у яких є ген стійкості до тіостриптону, незручне, оскільки у штамів S.kanamyceticus і S.globisporus з частотою ~1Х10-6 виникають спонтанні мутанти, резистентні до цього антибіотика. Спроби трансформувати протопласти цих штамів плазмідами, які містять гени стійкості до еритроміцину (plJ702 Erm") і апраміцину (pSET152), виявилися також невдалими. Однією з причин неуспішної трансформації протопластів S.kanamyceticus і S.globisporus можуть бути системи рестрикції-модифікації реципієнтних штамів. Тому ми трансформували протопласти цих штамів однонитковою ДНК, яку отримували різними шляхами: лужною денатурацією, кип'ятінням, клонуванням у фаговому векторі ¦1, та ці модифікації не дали жодного ефекту. Протопласти S.kanamyceticus перед трансформацією піддавали обробці ультрафіолетовими променями та нітрозогуанідином, однак і після цього трансформація не відбувалася. Плазмідну ДНК перед трансформацією протопластів S.globisporus обробляли фракцією S30, отриманою з цього штаму, розраховуючи на те, що вектор після такої обробки буде модифікований і не піддаватиметься дії ендонуклеаз штаму господаря. Та цей підхід також не дав позитивних результатів.

Альтернативним шляхом уведення плазмідної ДНК у штами актиноміцетів є нещодавно відкрите явище міжродової кон'югації в системі E.coli-Actinomycetales[8]. Метод перенесення плазмідної ДНК шляхом міжродової кон'югації дає змогу уникнути відносно трудомісткого етапу приготування протопластів, який до того ж може бути чинником, який спричинить нестабільність геному актиноміцетів.  Спеціально сконструйований донорний штам E.coli S17-1 містить у хромосомі Тґа-оперон плазміди RP4,  який забезпечує кон'югаційні функції in trans, тобто дає змогу  безпосередньо передавати клоновану у відповідних векторах ДНК з клітин E.coli в актиноміцети [7]. Векторні плазміди обов'язково містять район ініціації кон'югативного перенесення (огіТ) і огі реплікації в клітинах E.coli. Як вектори для міжродової кон'югації можуть бути використані космополітичні плазміди, наприклад, RSF1010 [8]. Крім того, створено два типи кон'югативних векторів: вектори, здатні до автономної реплікації в клітинах актиноміцетів (рКС1139, рКС1218, pOJ446), та інтегративні вектори (pTOI, pSET152) [9,10].

Було вирішено зробити спробу використати явище міжродової кон'югації в системі E.coli-Streptomyces. Як донор брали штам E.coli S17-1, що несе кон'югативну плазміду pSET152 (pиc.l). Ця плазміда містить attP - сайт і ген int актинофага (jС31, що надає їй здатності до інтеграції в хромосому реципієнтного штаму актиноміцетів.

Вибір інтегративного вектора зумовлений тим, що автономні плазміди часто нестабільно успадковуються в клітинах актиноміцетів і  більшою мірою зазнають структурних перебудов. Відтворення методики кон'югації E.coli-Streptomyces на LB-агарі, описаної Мазодієром [7], не дало позитивних результатів у дослідах із S.globisporus 1912 і S.kanamyceticus 1. Можливо, інтенсивний ріст газону донора в таких умовах призводив до суттєвого гальмування розвитку субстратного міцелію реципієнтного штаму і майже повного його видалення під час змивання газону E.coli. Негативні результати було отримано також, використовуючи середовище TSB [4]. Ефективною  виявилась модифікована методика кон'югації E.coli-Streptomyces, в якій для проведення схрещування і селекції екскон'югантів використовували середовища для вирощування актиноміцетів СР6 та СР12 [10].  Ми адаптували її для S.globisporus і S.kanamyceticus, використовуючи вівсяне середовище, на якому у цих мікроорганізмів простежується найліпші ріст і спороутворення. Такі умови

 

 

 

 

 

Рис 1. Будова  кон'югативної плазміди pSET152

 

забезпечують переваги для розвитку реципієнтної культури, а слабкий ріст газону донора дає змогу усунути етап його механічного видалення, яке супроводжується частковим, або майже повним змиванням клітин реципієнтного штаму актиноміцетів. В кінцевому варіанті схрещування проводили за описаною нижче методикою.

Донорний штам E.coli S17-1 вирощували до середини логарифмічної фази росту, осаджували центрифугуванням при 3000 об./хв. Отриманий осад ресуспендували в 100 мкл фізіологічного розчину до концентрації клітин 108 кл/мл. Суспензію спор штаму реципієнта в концентрації 107 спор/мл піддавали тепловому шоку при 50°С  протягом  10 хв, після чого спори інкубували протягом 3 год при температурі 37°С й аерації. Кон'югаційну суміш (100 мкл суспензії спор реципієнта і 200 мкл суспензії клітин донора) розподіляли на поверхні чашок з просушеним вівсяним середовищем. Інкубували протягом 18-20 год при температурі 28°С і заливали 1 мл водного розчину, що містив антибіотик, для селекції стрептоміцетів і налідиксову кислоту в кінцевій концентрації 200 мкг/мл. Екскон'юганти з'являлися через 3-4 дні. Частота виникнення екскон'югантів  щодо  кількості взятих у схрещування спор реципієнта для S.globisporus в середньому становила  3,.4х10-4, а для S. kanamyceticus - 1,2х10-4. Для оцінки стабільності успадкування маркера стійкості до апраміцину 200 незалежних клонів екскон'югантів вирощували на неселективному середовищі (чотири пересіви) і після висівання на середовище з апраміцином спостерігали 100% успадкування стійкості до цього антибіотика. Такі результати можуть свідчити про інтеграцію pSET152 у хромосому реципієнтних штамів. Для того, щоб знайти цьому підтвердження, з клітин одного з екскон'югангів S.globisporus виділили тотальну ДНК, розщепили її ендонуклеазою ВаmHI, провели електрофорез   в агарозному гелі, перенесли  отримані  фрагменти  на  нейлоновий фільтр   і    провели   ДНК-ДНК   гібридизацію з міченим дігоксигеніном Pstl-фрагментом                                                             плазміди  pSET152  розміром 760 пн, що містив огіТ.

Результати дали змогу переконатись, що відбувається інтеграція pSET152 в хромосому екскон'югантів S.globisporus. Зонд зв'язувався з двома ВаmНІ-фрагментами хромосомної ДНК екскон'юганта розміром ~6 і ~8 тисяч пар нуклеотидів (рис.2). Оскільки ДНК-зонд не містить сайтa розщеплення для ендонуклеази ВаmHI, а в плазміді pSET152 ВamHI-сайт є унікальним, ми зробили висновок, що в хромосомі екскон'юганта наявні дві копії pSET152.

Отже, міжродова кон'югація дає змогу подолати бар'єр для введення чужорідної генетичної інформації в штами S.globisporus і S.kanamyceticus, що сприяє   успішнішому генетичному вивченню представників цих видів актиноміцетів.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис.2. Результати ДНК-ДНК гібридизації BamHI-фрагментів сумарної ДНК штамів S.globisporus.

           1 - екскон"югант, що містить pSET152; 2 - вихідний штам 1912; 3 - плазміда pSET152.

Ця робота підтримана грантом  INTAS - Україна  95 - 0020.

 

___________________

 

1.   Демидчук Ю.О. Генетичний контроль стійкості Streptomyces kanamyceticus до

     аміноглікозидних антибіотиків. Автореф.дис... канд. біол. наук. Львів,1998. С.19.

2.  Мацелюх Б.П., Коновалова Т.А., Поліщук Л.В., Бамбура О.І.  Чутливість до

     ландоміцину А і Е стрептоміцетів, продуцентів полікетидних антибіотиків //   

     Мікробіол. журн. 1998.Т.60. №1. С.31-36.

3.  Маниатис Т., Фрич З., Сембрук Д. Методы генетической инженериии.      

     Молекулярное клонирование. М., 1984. С.480.

4.  Семенов С.М. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов: Справочник. М.,

     1990. С. 240.

5.        Boehringer Mannheim Biochemica. The DIG System User's Guide for Filter    

     Hybridization.-Leipzig:,1992. P.114.

6.  Hopwood D. A., Bibb M. J., Chater K. F. et al. // Genetic manipulation of Streptomyces:  

     a  laboratory manual. John Innes Foundation. Norwich. 1985. P. 355.

7.  Eamon P. Gormley.,Davies J. Transfer of Plasmid RSF1010  by Conujgation from    

     Escherichia coli to    Streptomyces lividans and  Mycobacterium smegmatis // Journal of      

     Bacteriology. Nov.1991. P.6705-6708.

8.        Mazodier Ph., Peffer R., Thompson Ch. Intergeneric conjugation between Escherichia    

     coli and Streptomyces species // J. Bacteriol. 1989. Vol. 171. P.3583.

9.        Bierman M., Logan R.,  Brien K. O.,et al. Plasmid cloning vectors for the conjugal        

transfer of DNA from Escherichia coli to Streptomyces spp // Gene., Vol.116 1992. P. 43 - 49.      

10.     Voeykova T., Emelyanova L. Conujgative Transfer of Plasmids from Escherichia coli   

      to Various Representatives of the Order Actinomycetales // Proceedings of the Ninth       

      Symposium on the Actinomycetales. 1995. P.90-91.