Дослідження активності рибофлавінкінази - першого ферменту біосинтезу флавінових нуклеотидів у мікроорганізмів
І.Білінська*, З.Гавриленко**, В.Кащенко**
* Львівський національний університет імені Івана Франка,
вул.Грушевського, 4, 79005.Львів, Україна
**Відділення регуляторних систем клітини Інституту біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України, вул.Драгоманова,14,79005 Львів, Україна
Флавінові коферменти - ФМН і ФАД - мають особливе значення у метаболізмі клітини. Як простетичні групи вони є в складі багатьох окисно-відновних ферментів (флавопротеїнів), які за різноманітністю біохімічних функцій вважаються найуніверсальнішими каталізаторами білкової природи. Відомо близько 120 флавопротеїнів, що беруть участь у метаболізмі цукрів, спиртів, амінокислот, деяких органічних і жирних кислот, процесах генерації енергії у дихальному ланцюгу, активації кисню, біолюмінесценції і фототропізму.
Перший етап перетворення рибофлавіну (РФ) у коферментні форми каталізує рибофлавінкіназа (РФ-кіназа) – АТФ-залежний фермент, який фосфорилює РФ з утворенням РФ-5'-фосфату (ФМН). Хоча дослідження цього ферменту розпочато у 50-х роках [14], на цей час активність РФ-кінази виявлена лише у деяких мікроорганізмів [1,7,10,12,13,15-19].
Нашою метою було систематичне вивчення активності РФ-кінази у різних представників бактерій, стрептоміцетів, дріжджів, міцеліальних і цвілевих грибів.
Використані штами мікрооргпнізмів та їхнє походження наведені у табл. 1-3. Бактерії роду Bacillus культивували в середовищі Спіцайзена [1], Streptomyces - у середовищі Красильнікова [2], Pseudomonas i Achromobacter - у модифікованому середовищі Чапека [8], Propionibacterium і Zymomonas - у синтетичному середовищі [9], решту бактерій - у м’ясопептонному бульйоні. Дріжджі вирощували в модифікованому середовищі Беркгольдера [5]. Глюкозо-сольове середовище для A. nidulans i N. crassa готували за Глазером і співавторами [3]. Біомасу P. vitale одержали з Державного підприємства Львівдіалік. E. ashbyii та A. gossypii культивували, як описано в [7]. Мікроорганізми вирощували при 30о С на круговій качалці (200 об./хв), P.freudenreichii, Р.denitrificans i Z. mobilis - у статичних умовах.
Активність РФ-кінази визначали у безклітинних екстрактах, одержаних балістичним методом руйнування клітин [6], або дезинтеграцією ультразвуком на апараті УЗДН 42-1 (60 с, 44 кГц). Безклітинні екстракти міцеліальниих та цвілевих грибів готували як описано в [7]. Активність РФ-кінази визначали згідно з відомим методом [5]. Реакційна суміш (загальний об’єм 1 мл) містила 0,1 мM РФ, 1 мM АТФ, 1 мM MgSO4, 0,1 М К-Na-фосфатний буфер, рН 8,0 і білок - 1-2 мг. Інкубацію проводили при 37оС протягом 30 хв, призупиняли реакцію заморожуванням проб при 20оС. У деяких експериментах використовували нещодавно розроблений метод визначення активності цього ферменту [4]. Активність РФ-кінази з повністю відновленим РФ (1,5-дигідро-РФ) визначали за модифікованою методикою [15]. За одиницю активності E РФ-кінази приймали кількість ферменту, що потрібна для фосфорилювання 1 мкмоль РФ за 1 хв при 37оС.
Активність РФ-кiнази бактерій наведена у табл.1.
Таблиця 1
Активність РФ-кінази у бактерій
| Питома активність,мкЕ/мг | |
Бактерії | з рибофла-віном | з дигідрорибо- флавіном |
Achromobacter cobalamini 53 | 20,6 | - |
Bacillus amyloliquefaciens A-50 | 21,5 | 26,4 |
Bacillus brevis BKM B-503 | 19,3 | 27,0 |
Bacillus cereus BKM B-373 | 109,0 | 105,4 |
Bacillus circulans BKПM B-1741 | 12,5 | 15,0 |
Bacillus licheniformis BKM B-511 | 20,5 | 22,0 |
Bacillus megaterium BKM B-512 | 118,4 | 117,5 |
Bacillus mesentericus BKM B-61 | 16,8 | 43,5 |
Bacillus subtilis BKM B-428 | 62,9 | 106,5 |
B.subtilis BKM B-501 | 61,0 | 108,8 |
B.subtilis BKПM B-5101 | 30,5 | 48,0 |
B.subtilis Shgw | 29,0 | 46,7 |
Brevibacterium flavum ATCC 14067 | 38,0 | - |
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 | 42,3 | - |
Escherichia coli K-12 | 20,3 | 70,0 |
Propionibacterium freudenreichii BKM B-104 | 32,7 | 37,5 |
Pseudomonas denitrificans BKM B-556 | 14,5 | 15,7 |
Saccharopolyspora erythraea 5 | 23,5 | 24,8 |
Streptomyces lividans 66 | 14,6 | 16,0 |
Streptomyces olivaceus ATCC 3335 | 106,3 | 105,2 |
Streptomyces rimosus ATCC 10970 | 93,2 | - |
Zymomonas mobilis B-3483M ВНДІГенетика | 14,5 | 18,6 |
Як бачимо, питома активнiсть ферменту була низькою i коливалась у межах 12,5-118,4 мкЕ/мг бiлка. Активнiсть РФ-кiнази, визначена іншими дослідниками, у Lactobacillus arabinosus смала дуже мале значення - 2,2 мкЕ/мг [19], в E. coli - 3 мкЕ/мг [17], а у Peptostreptococcus elsdenii - 500 мкЕ/мг [16].
Детально проаналізовано РФ-кіназну активність бактерій роду Bacillus, оскільки деякі автори [1], досліджуючи фермент у B.subtilis Shgw раніше розробленим нами методом [10], як субстрат використовували РФ, а інші [15] стверджували , що РФ-кіназа штаму B. subtilis H-52 здатна фосфорилювати тільки повністю відновлений РФ -1,5-дигідро-РФ. Остання сполука суттєво відрізняється від РФ не тільки структурою, а й конформацією ізоалоксазинового кільця [20].
На підставі визначення РФ-кіназної активності у 11 штамів цього роду бактерій досліджено, що фермент виявляв активність як з РФ, так і з 1,5-дигідро-РФ, хоча з останнім активність у бацил загалом була дещо вищою (табл.1). Ця ж закономірність була характерною для більшості досліджених нами бактерій. Не виявлено кореляції між РФ-кіназною та дигідро-РФ-кіназною активностями і відношенням мікроорганізму до концентрації кисню у культуральному середовищі. У мікроаерофільних бактерій P. freudenreichii, E. coli, Z. mobilis i P.denitrificans РФ-кіназна активність була низькою, проте і в деяких облігатних аеробів, як от B. circulans, B. brevis, B. mesentericus, S.lividans, перебувала приблизно на такому ж рівні. Лише у E.coli з відновленим РФ активність досліджуваного ферменту була у 3,5 раза вища порівняно з РФ, у інших спостерігалось незначне зростання дигідро-РФ-кіназної активності.
Отже, на підставі виконаних досліджень можна стверджувати, що у бактерій у процесі біосинтезу флавінових коферментів як субстрат РФ-кінази може використовуватись РФ, а також дигідро-РФ.
Визначено активність РФ-кінази у 27 штамів дріжджів різної родової і видової належності, на підставі чого виявлено (табл. 2), що загалом рівень актив-
Таблиця 2
Активність РФ-кінази у дріжджів
Дріжджі | Питома активність, мкЕ/мг |
Candida boidinii BCБ-719 | 246 |
Сandida flareri CBS-18 | 75 |
Candida krusei BKПМ Y-202 | 107 |
Candida maltosa BCБ-774 | 176 |
C.maltosa* | 528 |
Candida parapsilosis BKПМ Y-262 | 242 |
Candida sake BKПМ Y-194 | 175 |
Candida pseudotropicalis BKПМ Y-209 | 18,5 |
Candida tropicalis ИБФМ Y-303 | 49 |
Candida utilis 106 | 58 |
Debaryomyces kloeckeri BKM Y-102 | 98 |
Hansenula anomala BKM Y-611 | 103 |
Hansenula beijerinkii BKM Y-1403 | 85 |
Hansenula polymorpha BKПМ Y-140 | 101 |
H.polymorpha BKПМ Y-201 | 128 |
H.polymorpha BKПМ Y-201** | 1400 |
Hansenula wingei BKM Y-1398 | 114 |
Kluyveromyces lactis BKM Y-1527 | 10,5 |
Продовження таблиці 2
Дріжджі | Питома активність, мкЕ/мг |
Pichia guilliermondii ATCC 9058 | 122 |
Pichia ohmeri BKM Y-1255 | 65 |
Pichia pastoris GS 115 | 195 |
Pichia pinus 1031 | 85 |
Saccharomyces bayanus EC-1118 | 16 |
Saccharomyces cerevisiae LK-14 | 34 |
S.cerevisiae 71B-1122 | 9 |
Schwanniomyces occidentalis BKM Y-673 | 23 |
Zygowillia pastori BKM Y-513 | 97 |
* -Промислова біомаса Новополоцького заводу БВК (Білорусь).
**-Промислова біомаса НВО “Масма” (м.Дрогобич,Львівська обл.).
ності цього ферменту був вищий, ніж у бактерій (див. табл.1). Найменшу для цієї групи мікроорганізмів активність РФ-кінази було виявлено в екстрактах дріжджів роду Saccharomyces, деяких видів роду Candida, S. оccidentalis і K. lactis.
Не виявлено суттєвої різниці у рівнях активності РФ-кінази дріжджів C. flareri i P. guilliermondii, що належать до флавіногенних [11], та інших видів дріжджів, які не здатні до надсинтезу РФ.
Найвищу активність РФ-кінази мали метанол- (C. boidinii, Н. polymorpha,
P. pastoris, P. рinus) та парафінутилізувальні (C. maltosa, C. sake, С.parapsilosis,
P. guilliermondii) дріжджі, хоча у деяких штамів метилотрофних дріжджів, наприклад,Kloeckera sp. N 2201 [18] і H.polymorpha CBS 4732 [12], активність дослід-жуваного ферменту була низькою - на рівні 17-18 мкЕ/мг. Ще вища (див.табл.2) активність РФ-кінази у біомасі дріжджів H. polymorpha ВКПМ Y-201 та C. maltosa, вирощених у промислових умовах відповідно на метанолі та парафінах нафти, оскільки утилізація цих джерел вуглецю пов'язана з індукцією ФАД-залежної алкогольоксидази.
Таблиця 3
Активність РФ-кінази у грибів
Гриби | Питома активність,мкЕ/мг |
Ashbya gossipii BKM F-1398 | 380 |
Aspergillus awamori 120/177 | 39 |
Aspergillus nidulans BKM F-763 | 48 |
Aspergillus niger BKM F-1119 | 52 |
Eremothecium ashbyii 1906 | 1905 |
Neurospora crassa BKM F-184 | 35 |
Penicillium canescens BKM F-178 | 43 |
Penicillium vitale ІV | 173 |
Серед грибів (табл.3) високу питому активність РФ-кінази мали А.gossypii й E. ashbyii - відомі промислові продуценти РФ і ФАД. Дещо нижча активність ферменту визначена у P. vitale - промислового продуцента ФАД-залежної глюкозооксидази. РФ-кіназна активність решти досліджуваних грибів була на рівні більшості представників бактерій.
___________________
1. Бреслер Е.Г., Перумов Д.А.., Глазунов Е.А. и др. Исследование оперона биосинтеза РФ у Bacillus subtilis. Определение содержания АТФ:рибофлавин-5”-фосфо-трансферазы в клетках з различным генотипом // Генетика. 1977. Т.13. N5. С.880-887.
2. Гаузе Г.Ф., Преображенская Т.П., Свешникова М.А. и др. Определитель актиномицетов.- М., 1983.
3. Глазер В.М., Каменева С.В., Митронова Т.Н. Большой практикум по генетике микроорганизмов.- М., 1977. С.115-116.
4. Кащенко В.Е., Преображенская Е.Н., Сибирный А.А. Новый метод определения активности рибофлавинкиназы // Биохимия. 1994. Т.59. N8. C.1254-1265.
5. Кащенко В.Е., Шавловский Г.М. Очистка и свойства рибофлавинкиназы дрожжей Pichia guilliermondii // Биохимия. 1976. Т.41. N2. С.376-383.
6. Кащенко В.Е., Шавловский Г.М., Бабяк Л.Я., Жиленко Л.Н. Исследование субстратной и ингибиторной специфичности рибофлавинкиназы из дрожжей Pichia guilliermondii // Биохимия. 1978. Т.43. N12. C.2201-2210.
7. Колтун Л.В., Шавловский Г.М., Кащенко В.Е., Трач В.М. Изменение активности некоторых ферментов флавиногенеза в процессе культивирования гриба Eremothecium ashbyii // Микробиология. 1984. Т.53. N1. C.43-47.
8. Кучерас Р.В., Билинская И.С., Гирна О.В. Биогенетические взаимосвязи между флавинами и витамином В12 у Achromobacter cobalamini // Микробиол.журн.-1988. Т.50. N.3. С.46-49.
9. Кучерас Р.В., Гебгардт А.Г. Влияние аминокислот на кобамидсинтетическую активность Propionibacterium shermanii // Прикл.биохим.и микробиол.1972. Т.8. Вып.3. С.341-346.
10. Шавловський Г.М., Кащенко В.Є. Визначення рибофлавінкіназної активності дріжджів Pichia guilliermondii // Укр.біохім.журн. 1975. Т.47. N4. С.536-541.
11. Шавловский Г.М., Логвиненко Е.М., Струговщикова Л.П., Кащенко В.Е. Биосинтез флавинов и его регуляция у дрожжей Pichia guilliermondii // Укр.биохим. журн. 1975. Т.47. .N5. С.649-660.
12. Brook A.J., Diykhuizen L., Harder W. Regulation of flavin biosynthesis in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha // Arch. Microbiol. 1986. Vol.145. N1. P.62-70.
13. Efimov I., Kuusk V., Zhang X., McIntire W.S. Proposed steady-state kinetic mechanism for Corynebacterium ammoniagenes. FAD-synthetase produced by Escherichia coli // Biochemistry. 1998. Vol.37. P.9716-9723.
14. Kearney E.B., Englard S. The enzymatia phosporylation of riboflavin // J. Biol.-Chem. 1951. Vol.193. N 2. P.821-834.
15. Kearney E.B., Goldenberg J., Lipsick J., Perl M. Flavokinase and FAD-synthetase from Bacillus subtilis // J. Biol. Chem. 1979. Vol.254. N19. P.9551-9557.
16. Mayhew S.G., Wassink J.H. A continuous fruorometric assay for flavokinase. Properties of flavokinase from Peptostreptococcus elsdenii // Biochim. Biophys.Acta. 1977. Vol.482. N2. P.341-347.
17. Oya N. Riboflavin kinase. Flavinadenine dinucleotide pyrophosphorulase. Subcel-lular distributions of riboflavin kinase and FAD pyrophosphorylase in Escherichia coli // Vitamins. 1968. Vol.38. N1. P.50-54.
18. Shimizu S., Ishida M., Kato N. et al. Derepression of FAD pyrophosphorylase and flavin changes during growth of Kloeckera sp. N 2201 on methanol // Agric.Biol.Chem. 1977. Vol.11. P.2215-2220.
19. Snoswell A.M. Flavokinase of Lactobacillus arabinosus 175. // Austral.J.Exp. Biol.and Med.Sci. 1957. Vol.35. N5. P.427-436.
20. Stankovich M.T. Redox properties of flavin and flavoproteins / In Chemistry and Biochemistry of Flavoenzymes / Ed by F.Muller, 1991. Vol.1. P.401-425.