ТРАНСПОРТ ЗАЛІЗА  ТА ЙОГО РЕГУЛЯЦІЯ У ДРІЖДЖІВ

Д. Федорович

Відділення регуляторних систем клітини Інституту біохімії

ім.О.В Палладіна  НАН України, вул. Драгоманова, 14/16, Львів, Україна

e-mail: fedorovych@biochem.lviv.ua

 

Залізо є життєво важливим елементом для всіх аеробних організмів. Воно зв’язане з багатьма білками і ферментами, які каталізують реакції окислення і відновлення в клітині. Добре відома потреба в залізі для дихання, фотосинтезу, фіксації азоту, утворення дезоксирибонуклеотидів. Крім цього, залізо виконує низку регуляторних функцій у метаболізмі, зокрема бере участь у регуляції синтезу оксидоредуктаз, гему, форміатдегідрогенази, бактерійних протеїназ, дифтерійного та інших токсинів, ферментів метаболізму заліза та біосинтезу рибофлавіну (РФ).

У біологічному аспекті важливими є дві властивості заліза. В аеробних умовах іони двовалентного заліза швидко окислюються до Fe(III) і перетворюються у дуже слаборозчинний гідроокис заліза, що робить його недоступним для живих організмів. У високих концентраціях і Fe(II) , і Fe(III) , якщо є кисень, можуть бути токсичними для клітини внаслідок утворення високореактивних вільних радикалів. Такі властивості заліза змусили організми виробити спеціальні пристосування для забезпечення себе цим металом за наявності кисню, а також для підтримання вмісту заліза в клітині на нетоксичому рівні. Різноманітність цих пристосувань є важливим екологічним фактором, а також стосується здоров’я людини, оскільки зміни внутрішньоклітинного пулу заліза спостерігаються при багатьох захворюваннях, старінні, мікробній інфекції [27].

Багато мікроорганізмів - бактерій і грибів - у відповідь на недостатнє забезпечення залізом виділяють низькомолекулярні сполуки - (сидерофори), які мають високу спорідненість до Fe(III). Зв’язуючи залізо, сидерофори переводять його у розчинний стан [15]. Асиміляція заліза складається з декількох етапів: зв’язування комплексу Fe(III)-сидерофор з спеціальними мембранними білками, перенесення металу в клітини, вивільнення заліза з комплексу і включення його у ферменти і резервні білки. Інший механізм асиміляції заліза полягає у його позаклітинному відновленні і поглинанні розчинного Fe(II) за участю пермеаз. Системи поглинання заліза добре вивчені у Escherichia coli та деяких інших видів бактерій, а також у декількох видів грибів (Ustilago sphaerоgena). Механізми поглинання заліза  дріжджами до недавна не були з’ясовані. Останніми  роками  транспорт заліза у дріжджів активно досліджують у  декількох лабораторіях, досягнуто  значних успіхів у пізнанні того, як дріжджі розчиняють, транспортують і акумулюють залізо.

Ще  1970 р. Аткін і співавтори. [13], досліджуючи 142 штами 19 видів дріжджів, з’ясували, що більшість з них не екскретує сидерофорів у відповідь на недостатнє забезпечення залізом. Хоча сидерофори гідроксаматного типу виявлені у дріжджів, які належать до родів Rhodotorula, Rhodosporidium, Sporobolomyces. Sporobolus. В умовах  дефіциту заліза  дріжджі Rhodotorula pilimanae утворюють до 10 мг/л родоторулевої кислоти.

 Комлекс Fe(III)-родоторулева кислота не проникає в клітину, а тільки забезпечує розчинення  і зв’язування металу з мембранними білками-переносниками. Такий механізм поглинання заліза називають залізо-таксі [25].

У дріжджів Pichia guilliermondii ми виявили речовини пептидної природи з   Мr= 1000-1200 Да, здатні зв’язувати іони Fe(III) і забезпечувати його поглинання дріжджовою клітиною [3]. В умовах дефіциту заліза [23]  дріжджі Saccharomyces cerevisiae виділяють у середовище флюоресцентні фенольні сполуки (антранілат і гідроксиантранілат), які можуть сприяти транспорту заліза в клітини, стабілізуючи його в середовищі вирощування і підтримуючи у відновленому стані. Певну роль у забезпеченні дріжджів залізом можуть відігравати інтермедіати циклу Кребса - лимонна, молочна, янтарна кислоти -, які теж можуть зв’язувати залізо [26]. Засвоєння заліза з комплексів із цитратом, малатом, сукцинатом і оксалоацетатом досліджено у P. guilliermondii [2]. Виявлено, що поглинання заліза з комплексу з цитратом є активним транспортним процесом. Здатність до поглинання Fe(III) за участю цитрату ми виявили також у дріжджів Candida boidinii, S. cerevisiae, Debaryomyces kloeckeri, Candida utilis, Hansenula polymorpha. Цитратозалежна система транспорту заліза може брати участь не тільки в розчиненні цього металу в середовищі і транспорті його в клітини, а й у розчиненні полімерної плівки гідроокису заліза, яка утворюються за наявності в середовищі комплексів заліза з малатом, сукцинатом та іншими сполуками.

Незважаючи на відсутність власних сидерофорів, дріжджі здатні  використовувати залізо з комплексів із сидерофорами, синтезованими іншими  мікроорганізмами. Можливість поглинання заліза з комплексів з десфериоксаміном В, копрогеном, родоторулевою кислотою, а також з ЕДТА описана для P. guilliermondii [10]. Найвища швидкість поглинання 55Fe спостерігалась, коли  використовувалі фериоксамін В і родоторулеву кислоту. Найактивніше поглинали 55Fe клітини з логарифмічної фази росту. Клітини, вирощені в середовищі з низьким вмістом заліза (0,01 мг/л), поглинали 55Fe з усіх досліджених комплексів з значно вищою швидкістю, ніж залізовмісні клітини.

Отже, P. guilliermondii  може забезпечувати себе залізом, використовуючи сидерофоро- або цитратозалежну систему транспорту цього металу. S. cerevisiae  теж може використовувати залізо з фериоксаміну  В, ферикроцину і комплексу з родоторулевою кислотою.[22]. Здатність дріжджів асимілювати залізо з комплексів із сидерофорами, синтезованими іншими мікроорганізмами, можливо, забезпечує їм виживання в  природних умовах.

 

Асиміляція заліза з комплексів з хелатами потребує внутрішньоклітинної або позаклітинної дисоціації комплексу. Іони двовалентного заліза мають значно нижчу спорідненість до сидерофорів, тому при відновленні залізо звільняється з комплексу. Ферисидерофорредуктазні активності описані у багатьох мікроорганізмів [19]. Здатність до позаклітинного відновлення заліза, хелатованого сидерофорами, досліджена у S. cerevisiae [19],  а також у  P. guilliermondii, Pichia pinus. C. boidinii, D. kloeckeri, Candida famata, H. polymorpha, Candida crusei. Найвищу фериредуктазну активність клітин  P. guilliermondii простежували, коли використовували як субстрат Fe(III)-родоторулеву кислоту. Досліджено властивості частково очищеної цитозольної  фериредуктази P. guilliermondii. Виявлено, що донорами електронів можуть бути NADH і NADPH , іони Сu(II) і Mg(II) стимулюють відновлення Fe(III) до Fe(II).

Для вираження зовнішньомембранної фериредуктазної активності  S. cerevisiae необхідна експресія двох генів - FREI і  FREII -, яка лімітує асиміляцію Fe(II). Денціс і співавтори. [18] дослідили, що мутація в гені FREI  приводить до різкого зниження (на 90-95%) фериредуктазної активності. Фериредуктаза S. cerevisiae є NADP-залежним білком, частково очищені препарати з плазматичних мембран здатні каталізуввати перенесення електронів з NADPH на різноманітні Fe(III)-комплекси та акцептори електронів (фериціанід, дихлорфеноліндофенол). Для максимальної активності фермент потребує FMN.

Фериредуктазна активність S. cerevisiae зростає у декілька  разів у випадку недостатнього  забезпечення клітин залізом. Регуляція залізом здійснюється через активатор транскрипції, який індукується в умовах  дефіциту заліза [18]. В контролі фериредуктазної активності беруть участь також cAMP і гем. Для високоспорідненого транспорту  Fe(II) в дріжджову клітину необхідним  є поглинання міді. Для асиміляції заліза S. cerevisiae важливими є два гени: CTRI , що кодує білок, потрібний для поглинання міді,  і FET3, який кодує Сu-залежну оксидазу [14]. Механізм зв’язку між цією оксидазою і транспортом заліза залишається нез”ясованим, не ідентифіковані і структурні компоненти Fe(II)-транспортера. Однак доведено, що транспорт Fe(II) регулюється наявністю заліза. Активатор транспорту Fe(II) - продукт гена AFTI - активує і фериредуктазу, і FET3, і  Fe(II)-транспорт у відповідь на дефіцит заліза шляхом контролю транскрипції. Другим геном, який бере участь у відновній асиміляції заліза у S. cerevisiae,  є MACI, продукт якого , можливо, взаємодіє з міддю і регулює експресію FRE-генів [20].

Фериредуктазна активність P. guilliermondii, D. kloeckeri, C. famata, C. boidinii теж залежить від вмісту заліза в середовищі вирощування [4]. Здатність відновлювати Fe(III) до Fe(II) залежить від природи комплексу Fe(III)-сидерофор і є максимальною у логарифмічній фазі росту. Проте фериредуктазна активність C. crusei, H. рolymorpha і P. pinus не змінюється зі зменшенням  вмісту заліза в середовищі вирощування. Активність фериредуктази S.cerevisiae і P.guilliermondii зростає при наявності іонів міді. Внесення Cu(II) у концентрації 2х10-4М в інкубаційне середовище стимулює відновлення Fe-цитрату залізодефіцитними клітинами P.guilliermondii у чотири , а залізовмісними - у два рази [5].

У P.guilliermondii селекціоновані мутанти, позначені hit (high iron transport), які з високою  швидкістю поглинають 55Fe, мають підвищений у 3-4 рази вміст заліза в клітинах, високу фериредуктазну активність і синтезують на порядок більше РФ, аніж батьківський штам [1,5]. Про зв’язок між метаболізмом заліза і здатністю деяких видів дріжджів до утворення значних кількостей РФ відомо давно, але фізіологічна роль цього явища до цього часу не з’ясована. В умовах дефіциту заліза дріжджі  P. guillіermondii мають високу флавіногенну активність і високу швидкість поглинання заліза. Мутанти з пошкодженою регуляцією біосинтезу РФ - rib80 і rib81 - не тільки здатні до надсинтезу РФ, а й, подібно до hit-мутантів, з високою швидкістю поглинають 55Fe, мають підвищену фериредуктазну активність. Але тільки в клітинах мутантів rib80 знайдено підвищений у декілька разів вміст заліза [9,11,12]. Суміщення мутацій rib80 і rib81 в одному гаплоїдому геномі  приводить не тільки до значного зростання флавіногенної активності дріжджів P. guilliermondii, а й до десятикратного підвищення швидкості поглинання 55Fe [8]. Провівши комплементаційний та сегрегаційний аналіз мутантів rib80, rib81 і hit, ми виявили, що описаний фенотип спричинений пошкодженням трьох різних генів. Отже, у P. guilliermondii продукти трьох генів негативного типу дії - RIB80, RIB81 і HIT - беруть участь у регуляції двох процесів: транспорту заліза і флавіногенезу. Спільні механізми контролю постачання клітин залізом і флавінами можуть бути важливими для функціонування дихального ланцюга дріж-джів. Координована регуляція біосинтезу РФ і транспорту заліза функціонує і в D. kloeckeri [6]. Флавіногенні штами D.kloeckeri , отримані шляхом селекції з використанням мутантів з неповним блоком гена RIB2 , так само, як і мутанти P. guilliermondii , селекціоновані таким же способом, крім здатності до надсинтезу РФ, характеризувались підвищеною швидкістю транспорту 55Fe і вищим вмістом заліза в клітинах.

Раніше  було висловлено припущення [7], що біосинтез РФ контролюється репресором - гетероолігомерним білком, який складається з продуктів генів RIB80 і RIB81. Очевидно, що цей  репресор регулює один з етапів транспорту  іонів заліза, який лімітує швидкість цього процесу. Можливо, що мішенню дії репресора є фериредуктаза. Клітини мутантів rib80, rib81 і hit відновлюють Fe(III) у Fe(II) у комплексах з різними сидерофорами, цитратом і ЕДТА з високою швидкістю [4]. Яким є механізм дії продуктів генів, що контролюють біосинтез РФ, на процес відновлення заліза - невідомо.

Результати дослідження асиміляції заліза дріжджами свідчать про те, що ці одноклітинні організми мають багатокомпонентну систему транспорту цього металу, яка підлягає багаторівневому контролю. Дріжджові клітини об’єднують у собі різноманітні механізми постачання залізом, які  характерні для вищих еукаріот. Вони можуть отримувати залізо не тільки завдяки фериредуктазній системі, а й використовуючи високоспецифічну систему транспорту іонів Fe(II), а також сидерофорозалежну транспортну систему. Тому дослідження поглинання іонів заліза клітинами дріжджів, як моделлю еукаріотичної клітини, є важливими для пізнання різноманітних аспектів метаболізму цього металу у вищих еукаріот.

___________________

 

 

1.        Стенчук Н.Н., Протченко О.В., Федорович Д.В., Шавловский Г.М. Мутанты     Pichia      guilliermondii с повышенной способностью к восстановлению рибофлавина и ионов железа // Генетика 1991. Т.27. N3. С.561-564.

2.     Федорович Д.В., Шавловский Г.М., Дедишин Е.Е. О системе транспорта железа с участием цитрата у Pichia guilliermondii // Микробиология. 1989. Т.58. N3. С.370-376. 

3.    Федорович Д.В., Шавловский Г.М., Дедышин Е.Е. Обнаружение железосвязывающих веществ в культуральной жидкости дрожжей-аскомицетов // Микробиология. 1992. Т.61. N3. С.347-351.

4.    Федорович Д. В., Протченко О.В., Шавловский Г.М. Ферриредуктазная активность клеток Pichia guilliermondii и особенности ее регуляции // Микробиология. 1992. Т.61, N1. С.11-17.

5.    Федорович Д.В., Протченко О.В.,Шавловський Г.М. Фериредуктаза Pichia guilliermondii: властивості і регуляція активності та синтезу //Укр. биохим. журн. 1995. Т.67. N1. С.32-38.

6.    Федорович Д.В., Сидорович И.Б., Протченко О.В., Шавловский Г.М. Изучение механизмов регуляции биосинтеза рибофлавина у дрожжей Debaryomyces kloeckeri // Микробиология. 1997. T.66. N5. С.595-599.       

7.    Шавловский Г.М., Логвиненко Е.М. Роль железа в регуляции синтеза белков у микроорганизмов // Успехи микробиол. 1988. Т.29. С.108-133.

8.     Шавловский Г. М., Стенчук Н.Н., Куцяба В.И., Федорович Д.В. Совместное влияние мутаций rib80, rib81 и резистентности к 8-азагуанину на биосинтез рибофлавина у Pichia guilliermondii // Прикл. биохимия и микробиология. 1997. N1. С.61-65.

9.     Шавловский Г.М., Федорович Д.В., Колтун Л.В., Логвиненко Е.М. Выделение и характеристика флавиногенных штаммов Pichia guilliermondii, несущих регуляторную мутацию rib80 (ribR) // Микробиология. 1985. Т.54. N6. С.919-926.

10. Шавловский Г.М., Федорович Д.В., Назарук М.И. Некоторые свойства системы транспорта железа и регуляции ее синтеза у Pichia guilliermondii // Микробиология. 1988. Т.57. N1. С.20-25.

11. Шавловский Г.М., Федорович Д.В., Куцяба В.И. и др. Участие гена RIB80 в регуляции биосинтеза рибофлавина и транспорта железа у дрожжей Pichia guilliermondii //  Генетика. 1992. Т.28. N5. С.25-32.

12. Шавловский Г.М., Федорович Д.В., Бабяк Л.Я. Влияние мутации rib81 на биосинтез рибофлавина и транспорт железа у дрожжей Pichia guilliermondii // Микробиология. 1993. Т.62. N5. С.897-903.

13.  Atkin C.H.,Neilands J.B, Phaff H.J. Rhodotorulic acid from species of Leucosporidium, Rhodosporidium, Rhodotorula, Sporidiobolus and Sporobolomyces and a new alanine-containing ferrichrom from Cryptococcus melibiosum // J. Bacteriology. 1970. Vol.103. N3. P.722-733.

14.  Askwith C., Eide D.,Van Ho A., et al. The FET3 gene of Saccharomyces cerevisiae encodes a multicopper oxidase required for ferrous iron uptake // Cell. 1994.Vol.76. N1. P.403-410.

15.  Bagg A., Neilands J.B. Molecular mechanism of regulation of siderophore-mediated iron assimilation // Microbiol. Rewiews. 1987. Vol.51. P.509-518.

16.  Bienfait H.F. Regulated redox processes at the plasmalemma of plaut root cells and their function in iron uptake // J.Bioenerg.Biomembrans. 1985. Vol.17. N. P.616-622.

17.  Dancis A.., Klausner R.D.,Himnebusch A.G. and Barriocanal J.G. Genetic evidence that ferrireductase is required for iron uptake in Saccharomyces cerevisiae // Mol.Cell.Biol. 1990. Vol.10. N5. P.2294-2301.

18.  Dancis A., Roman D.J., Anderson G. et al. Ferric reductase of Saccharomyces cerevisiae: molecular characterization, role in iron uptake and transcriptional control by iron // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1992. Vol.89. N 9. P.3869-3873.

19.  Hider R.C. Siderophore mediated adsorbtion of iron // Structure and Binding. Siderophores from microorganisms and plants. Berlin-Heidelberg. Springer Verlag. 1987. P.25-58.

20.  Jungmann J., Hans-Albert, Lee G.et al. .MAC1, a nuclear regulatory  protein  related  to Cu-dependent  transcription  factors  is  involved  in  Cu/Fe utilisation  and  stress  resistance  in  yeast. // EMBO J. 1993. Vol.12. P.5051-5056.

21.  Lesuisse E., Raguzzi F., Crichton R.R. Iron uptake by the yeast Saccharomyces cerevisiae : Involvement of a reduction step // J.Gen.Microbiol. 1987. Vol.183. P.3229-3236.

22.  Lesuisse E., Labbe P. Reductive and nonreductive mechanisms of iron assimilation by the yeast Saccharomyces cerevisia e// J.Gen. Microbiol. 1989. Vol.135. P.257.

23.  Lesuisse E., Simon M., Klein R.,and Labbe P. The plasma membrane ferrireductase activity of Saccharomyces cerevisiae in partially controlled by cyclic AMP // J. Gen. Microbiol. 1992. Vol.138. P.85-89.

24.  Lesuisse E., Labbe P. Reductive iron assimilation in Saccharomyces cerevisiae // In:,,Metal Ions in Fungi”(Winkelman G. and Winge A.R., eds). N.J. Marcel Deccer Inc. 1994. P.149-178.

25.  Neilands J.B. Sirerophores  of  bacteria  and  fungi  // Microbiol. Sci. 1984. Vol.1. P.9-14.

26.  Schwyn B., Neilands J.B. Universal chemical assay for the defection and determination of siderophores // Anal.Biochem.1987. Vol.160. P.47-53.

27.  Weinberg E.D. Role of iron in infection and neoplasia // J.Farmacology. 1985. Vol.16. N4. P.358-364.