ВПЛИВ NO НА АГРЕГАЦІЙНУ ФУНКЦІЮ ТРОМБОЦИТІВ ПРИ ІНСУЛІНЗАЛЕЖНОМУ ЦУКРОВОМУ ДІАБЕТІ. МОРФОФУНКЦІОНАЛЬНІ ЗМІНИ КРОВ’ЯНИХ ПЛАСТИНОК

Л.Токарєва^*, Н.Сибірна^*, О.Кулачковський^**, М.Великий^**

^*Львівський національний університет імені Івана Франка

вул. Грушевського, 4, 790005, Львів, Україна

Дослідження останніх років виявили, що тромбоцити містять Са²⁺-залежну NO-синтазу, яка активується внаслідок стимуляції тромбоцитів під час їхнього контакту з пошкодженими судинами або під впливом біологічно активних речовин. Це призводить до синтезу оксиду азоту з L-аргініну [1-3]. Генерація оксиду азоту спричиняє активацію розчинної гуанілатциклази (ГЦ) за гемзалежним механізмом. NO-група взаємодіє з Fe³⁺ гему, у цьому випадку Fe³⁺ виступає з площини порфіринового кільця, в результаті чого утворюється комплекс «нітрозил-гем», який і є активатором ГЦ. Важлива роль гему в регуляції ГЦ була підтверджена після дослідження хімічної природи ендотеліального фактора релаксації. Ним виявився ендогенний NO. Його антиагрегаційні та антигіпертензивні властивості пов’язані з прямою стимуляцією розчинної ГЦ. Наслідком активації розчинної ГЦ є підвищення вмісту цГМФ у тромбоцитах, що саме по собі є сигналом до дезагрегації тромбоцитів [4].

Метою нашої роботи було дослідження впливу оксиду азоту на агрегацію та морфофункціональний стан тромбоцитів у людей, хворих на інсулінзалежний цукровий діабет (ІЗЦД), а також виявлення за допомогою електронної мікроскопії кореляції між структурними та функціональними змінами у тромбоцитах та між ступенем цих змін і проявами ускладнень при цій патології.

Для дослідження ми використовували кров здорових донорів та хворих на ІЗЦД. Забір матеріалу проводився у силіконізовані пробірки з 3,8% розчином цитрату натрію у співвідношенні 9:1 [5]. Дослідні зразки були поділені на дві групи. Перша група - це зразки, які безпосередньо використовувались для досліду, друга група -

зразки, які попередньо інкубувалися з L-аргініном (кінцева концентрація 10 мкМ) 10 хв при 37 °С. Агрегацію тромбоцитів досліджували на лазерному аналізаторі «Біола» (НПФ, Росія), як індуктор агрегації використовували ADP (кінцева концентрація 5 мкМ) [6]. Дослідження ультратонкої структури тромбоцитів проводили методом трансмісійної електронної мікроскопії на зрізах за допомогою електронного мікроскопа ПЕМ-100, виділення, відмивання та фіксацію тромбоцитів - за

методикою Васільєвої та Баркагана [7].

Аналіз процесу агрегації тромбоцитів по кривій середнього розміру агрегатів виконували за такими параметрами: 1) ступінь агрегації, який визначається як максимальне значення середнього розміру агрегатів після додавання індуктора і вимірюється у відносних одиницях; 2) показник агрегації, який відображає відносне збільшення радіуса агрегатів; 3) час агрегації - інтервал між індукцією та досягненням максимального ступеня агрегації.

На рис.1 зображені криві ADP-індукованої агрегації тромбоцитів здорових людей. Аналізуючи дані табл.1, слід зазначити, що після інкубації тромбоцитів з L-аргініном ступінь агрегації знижується в 1,8 раза, показник агрегації - в 2,8 раза, а час агрегації - в 0,86 раза.

Таблиця 1

Основні показники агрегації тромбоцитів здорових донорів (М±m, n=11)

Умови	Ступінь агре-гації, відн. од.	Показник агрега-ції, відн. од.	Час агрегації
До інкубації з L-аргініном	2.88 ± 0.08	7.29 ± 0.02	349 ± 13.11
Після інкубації з L-аргініном (10 мкМ) 10 хв - 37°С	1.61 ± 0.02	2.59 ± 0.03	300 ± 13.53

Різниця вірогідна порівняно з контролем, р < 0,05

На рис.2 зображені криві ADP-індукованої агрегації тромбоцитів людей, хворих на ІЗЦД. Динаміку зміни досліджуваних показників агрегації тромбоцитів людей, хворих на ІЗЦД, наведено у табл.2. Після інкубації з L-аргініном тромбоцитів людей, хворих на ІЗЦД, ступінь агрегації знижувався в 2,1 раза, показник агрегації – відповідно в 4,5 раза, а час агрегації збільшувався в 0,3 раза.

Всі реакції, пов’язані з агрегацією тромбоцитів, супроводжуються змінами на морфо-фізіологічному рівні, тому дослідження структури грануломеру, а також клітинного скелета кров’яних пластинок методом трансмісійної електронної мікроскопії мало вирішальне значення для підтвердження отриманих нами результатів.

Аналізуючи літературу, де предметом досліджень були морфологічні зміни у тромбоцитах унаслідок зміни їхньої агрегаційної здатності, ми дійшли до висновку, що найбільш цікавим об’єктом для нас є a-гранули тромбоцитів, ПВС (surface connected system) - поверхнево-вакуолярна система, щільні тільця (dense bodies), мікрофіламенти. a-гранули та щільні тільця - це депо біологічно активних речовин: гідролітичних ферментів, фактора росту, серотоніну, Ca²⁺ , аденіннуклеотидів (гранулярний пул накопичення ADP- storage pool). У пластинках, які циркулюють у кровотоці, a-гранули функціонально інертні [8].

Рис.1. ADP-індукована агрегація тромбоцитів здорових донорів.

1 – агрегація до інкубації з L-аргініном; 2 – агррегація після інкубації з

L-аргініном (10 мкМ)

Таблиця 2

Основні показники агрегації тромбоцитів людей, хворих на ІЗЦД (М±m, n=11)

Умови	Ступінь агрегації, відн. од.	Показник агрега-ції, відн. од.	Час агрегації
До інкубації з L-аргініном	6.80 ± 0.19	45.24 ± 0.13	118.33±1.45
Після інкубації з L-аргініном (10 мкМ) 10 хв - 37 °С	3.31 ± 0.07	9.96 ± 0.05	298 ± 13.53

Різниця вірогідна порівняно з контролем, р < 0,05

Рис.2. ADP-індукована агрегація тромбоцитів людей, хворих на ІЗЦД.

1 – агрегація до інкубації з L-аргініном; 2 – агррегація після інкубації з

L-аргініном (10 мкМ)

При цукровому діабеті простежується підвищена активація тромбоцитів та їхня здатність до агрегації. В експерименті цей процес ми можемо простежити за утворенням чисельних псевдоподій. Відбувається переміщення до центру та злиття a-гранул з вакуолями ПВС. Вихід вмісту a-гранул та щільних тілець супроводжується

зменшенням електронної густини a-гранул (світлі гранули). Серотонін, який вивільняється у результаті реакції вивільнення (release reaction), спочатку ініцією, а потім інгібує агрегацію у судинах за межами зони тромбоутворення. Наявність великої кількості пластинок з чітко вираженими довгими псевдоподіями є ознакою активації тромбоцитів.

Під час інкубації з L-аргініном пригнічувалась реакція вивільнення. В експерименті ми спостерігали пластинки з короткими, округлими псевдоподіями, збільшення кількості a-гранул з нормальною електронною густиною (темні гранули), a-гранули рівномірно розподілялися у цитоплазмі, скорочувались канали ПВС, тромбоцит набував нормальної форми. Наявність таких тромбоцитів з округлими псевдоподіями свідчить про зворотну агрегацію.

Результати наших досліджень підтверджують той факт, що при ініціації агрегації ADP підвищується чутливість розчинної ГЦ до дії активатора, у нашому випадку - NO. Це призводить до накопичення цГМФ та інгібування агрегації.

Отже, ми вперше дослідили, що інкубація цільної крові з L-аргініном призводить до зниження агрегаційної здатності тромбоцитів як у здорових донорів, так і у хворих на ІЗЦД. Однак при ІЗЦД ці зміни більше виражені, ніж у здорових донорів. Це свідчить про підвищену чутливість тромбоцитів до дії NO при досліджуваній патології.

За допомогою електронної мікроскопії ми вперше виявили морфологічні зміни ультратонкої структури тромбоцитів людей , хворих на ІЗЦД, а також корекцію цих змін після впливу NO внаслідок попередньої інкубації з L-аргініном. Застосування методу морфометричного аналізу за допомогою електронної мікроскопії дає змогу кількісно відобразити ступінь патологічних змін, виявити кореляцію між структурними та функціональними порушеннями тромбоцитів, а також зв’язок між глибиною цих змін та проявами ускладнень при цукровому діабеті.

____________________

1. Васильева Е.Ю., Баркаган З.С. Исследование морфологии тромбоцитов при помощи сканирующей электронной микроскопии //Лаб.дело. 1982. №6. С.26-30.

2. Вашкинель В.К., Петров М.Н. Ультраструктура и функция тромбоцитов человека. Л.1982.

3. Ермолаева Т.А. Методы выделения из крови интактных тромбоцитов // Лаб. дело. 1991. № 10. С.15-18.

4. Махневич Т.Р., Дробот Л.Б., Великий М.М. та ін.Агрегаційна та антиоксидантна активність тромбоцитів при ІЗЦД // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія.1998. №3-4(3).С.85-90.

5. Северина И.С. Растворимые формы гуанилатциклаз. Механизм активации оксидом азота. Роль в агрегации тромбоцитов // Вест. Рос. АМН. 1995. №2. С.34-39.

6. Marietta M, Facchinetti F. L-arginine infusion decreases platelet aggregation through an intraplatelet NO release // Thrombosis Research. 1997. Vol.88.P. 229-235.

7. Radomski M.W., Palmer R.M. An L-arginine/NO pathway present in human platelets regulates aggregation // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1990. Vol.87. P.5193-5197.

8. Sarchielli P., Russo S. L-arginine/NO pathway activation in platelets of migraine patients// Acta Neurol. Scand. 1996. Vol.94. P.151-160.