ВУГЛЕВОДНОГО ОБМІНУ ЕРИТРОНУ ЩУРІВ ЗА УМОВ ІОНІЗУЮЧОГО ВИПРОМІНЮВАННЯ НИЗЬКОЇ ІНТЕНСИВНОСТІ
Г.Бесерріль Арагон, Л.Старикович, Я.Верніковська , Т.Виговська,
М.Великий
Львівський національний університет імені Івана Франка
вул. Грушевського,4, 79005 Львів, Україна
Відомо, що внаслідок дії іонізуючого випромінювання найперше уражуються клітини з високим рівнем проліферації, зокрема клітини кісткового мозку та ентероцити. В процесі дозрівання еритроїдних клітин кісткового мозку утворюються еритроцити, які вважають радіорезистентними. Одержані нами результати [2,3] свідчать, що в еритроцитах відбуваються суттєві зміни активності ферментів гліколізу за умов низькоінтенсивного опромінення. Виявлено, що ці зміни зумовлюються вихідним рівнем активності індивідуальних ферментів, що в свою чергу визначається фізіологічним станом організму і величиною сумарної дози, отриманої піддослідними тваринами за весь період опромінення. Ці результати узгоджуються з даними Бурлакової та співавторів [1], які простежували бімодальну залежність ефектів від величини сумарної дози опромінення.
Згідно із сучасними даними [8], іонізуюче випромінювання може мати як пошкоджуючий (альтеруючий), так і подразнюючий (стресуючий) ефекти. Іонізуюча радіація високої інтенсивності спричиняє пошкоджуючий ефект, що призводить до хромосомних аберацій, мутацій, злоякісної трансформації та загибелі клітин. Хронічне рентгенівське опромінення низької інтенсивності призводить до низки стресуючих ефектів, які виявляються в пошкодженні мембранних структур та в активації симпато-гіпофізарно-надниркової системи . За іншою гіпотезою, адаптивна відповідь на дію іонізуючого випромінювання низької інтенсивності може призводити до змін у геномі і “трансформації малої популяції клітин онтогенетичного резерву” [10]. Гераскін [6] припустив, що стратегія відповіді клітини на дію екстремальних факторів, окрім пасивної адаптивної є також активною. Активна стратегія має універсальний характер і виявляється в експресії генів SOS-відповіді, а також у дуплікативній транспозиції мобільних генетичних елементів. Виявлено, що малі дози іонізуючої радіації викликають зміни синтезу і продукції цитокінів та ініціацію апоптичних процесів [15]. Досліджено, що зниження активності гексокінази та лактатдегідрогенази внаслідок впливу іонізуючої радіації супроводжується зростанням активності ключового ферменту фосфоглюконатного шляху – глюкозо-6- фосфатдегідрогена-
зи – та зміною шляху метаболізму вуглеводів( з гліколітичного на пентозофосфатний) [2].
Виявлені зміни активності ензимів зумовлюються низкою чинників, серед яких найбільш вірогідним є перерозподіл множинних молекулярних форм ферментів за умов дії екстремальних факторів. Тому ми дослідили ізоферментні спектри гексокінази – пускового ферменту гліколізу та глюкозо-6-фосфатдегідрогенази – ключового ферменту пентозофосфатного циклу в еритроцитах, еритроїдній та мієлоїдній клітинних фракціях кісткового мозку.
У дослідах застосовували безпородних самців білих щурів масою 130-180 г. Тварин опромінювали на апараті РУМ-11 щодобовою дозою 0,258 мКл/кг протягом 30 діб при потужності дози 0,001075 мКл/кг.с, напрузі 110 кВ, силі струму
5 мА, фільтрах Си – 0,5 мм, Al –1 мм, шкірно-фокусній відстані 78 см. Еритроцити двічі промивали 0,155 М розчином хлориду натрію і центрифугували при 1000 g в охолодженому стані. Окремі клітинні популяції отримували фракціонуванням кісткового мозку в градієнті фікол-верографін за методикою [9]. У гемолізатах досліджували ізоферментний склад глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (Г-6-ФДГ) /КФ 1.1.1.49 / та гексокінази (ГК) /КФ 2.7.1.1/ [5].
Г-6-ФДГ забезпечує метаболічні потреби клітин у відновних еквівалентах – NADPH. Головні відновні процеси,які відбуваються в еритроцитах з використанням NADPH- забезпечення високого ступеню відновленості глутатіону і заліза гему та захист еритроцитарної мембрани від уражуючої дії перекисів. Г-6-ФДГ представлена широким спектром ізозимів і забезпечує цілісність та функціональний стан мембран еритроцитів. Зниження інтенсивності Г-6-ФДГ-реакції зумовлює порушення їхніх функцій, деструкцію і може бути причиною гемолітичних анемій [6].Активний фермент є димером, що складається з двох ідентичних субодиниць, але за умов дії різних факторів може переходити у дві інші форми - мономер і тетрамер. Виявлено значну чутливість ферментів фосфоглюконатного шляху, зокрема Г-6-ФДГ до дії іонізуючої радіації в таких тканинах, як печінка, міокард, кістковий мозок, скелетні м¢язи, а також еритроцити кролика [11].
На підставі досліджень, які виконали на еритроцитах білих безпородних щурів, виявили значну різнорідність ізоферментних спектрів Г-6-ФДГ піддослідних тварин , що, очевидно, пов¢язано з функціонуванням ряду генів цього ферменту в попередниках еритроцитів щурів . Тому для відбору тварин, генетично однорідних за Г-6-ФДГ,виконували аналіз ізоферментних спектрів Г-6-ФДГ еритроцитів периферичної крові для кожної тварини в групі з 64 самців. Виявили чотири головні типи ізоферментних спектрів: перший тип-у групі з 45 щурів, другий 2 – з 8, третій- 3 – з 3, четвертий – з 9 тварин. Характеристика виявлених різних типів ізоферментних спектрів приведена в табл.1.
Найпоширеніший, перший тип представлений головними 2-ю та 3-ю, а також мінорними 1-ю, 4-ю і 5-ю фракціями. Існування множинних форм Г-6-ФДГ може бути викликано як наявністю ряду алельних і неалельних генів, так і посттрансляційною модифікацією ферменту. Одним із шляхів такої модифікації є індукована незворотним зв¢язуванням NADP+ часткова деградація ферменту [13]. У наступних дослідах застосовували лише щурів першого найбільш поширеного типу ізоферментного спектра Г-6-ФДГ. З’ясували що за умов дії іонізуючої радіації низької інтенсивності в окремих клітинних популяціях кісткового мозку відбувається перерозподіл електрофоретичних фракцій ізоферментних спектрів Г-6-ФДГ. В еритроїдній популяції
кісткового мозку зменшується вміст головної, 2-ї, фракції (табл.2) унаслідок зростання 3-ї та тенденції до зростання 1-ї фракції.
Таблиця 1
Відносна ферментативна активність (%) Г-6-ФДГ еритроцитів периферичної крові щурів з різними типами ізозимних спектрів
Номер електрофоретичної фракції | Типи ізозимного спектрa | |||
Перший | Другий | Третій | Четвертий | |
n=45 | N=8 | n=3 | n=9 | |
1 4,54±0,59 2,44±0,42 8,66±1,01 2 69,99±3,24 26,66±2,34 52,85±5,58 7,64±8,44 3 20,98±2,20 66,50±4,13 47,40±7,71 3,70±0,51 4 3,96±0,59 5 1,66±0,19 | ||||
Найчіткіше, цей ефект виявляється на 20-ту добу опромінення. У мієлоїдній популяції простежували значне зменшення головної, 2-ї, фракції унаслідок зростання вмісту 1-ї мінорної фракції на 20-ту добу майже в 2,5 раза.
Отже, найсуттєвіших змін зазнає головний, другий, компонент, як в еритроїдному, так і в білому ряді. Можна припустити, що іонізуюча радіація низької інтенсивності спричиняє низку ефектів, серед яких є вірогідною експресія певних генів Г-6-ФДГ у червоному та білому ростках кісткового мозку, що виявляється в перерозподілі множинних молекулярних форм ферменту. Можливим є й альтернативний механізм, пов¢язаний з підсиленням посттрансляційної модифікації ферменту за умов дії опромінення. Аналогічні ефекти зі збільшенням вмісту швидкомігруючого компонента Г-6-ФДГ простежували при лейкемії [13]. У різних тканинах щурів ГК представлена чотирма молекулярними формами – ізозимами, які є тканиноспецифічними і кодуються відповідними генами [14]. В результаті виконаних досліджень виявлено в нормі в еритроїдній популяції та попередниках білого ряду чотири електрофоретичні фракції, серед яких переважала ізоформа II (табл.3)
Відомо, що ізофермент ГК II міститься в тканинах, метаболічна активність яких значно змінюється зі зміною функціонального навантаження в умовах значних коливань вмісту метаболітів. За умов дії опромінення щодобовою дозою 0,258 мКл/кг у червоному ростку виявили зменшення відносної ферментативної активності ГК III тільки на 10-ту добу і тенденцію до зростання вмісту ізоформи II, що може свідчити про первинну адаптивну відповідь організмів на збільшення вмісту пірувату та лактату у процесі низькоінтенсивного опромінення. В білому ростку достовірне зниження вмісту повільномігруючих ензимів I та II в усі терміни супроводжувалось
Таблиця 2
Відносна ферментативна активність (%) ізоформ Г-6-ФДГ в еритроїдній і мієлоїдній популяціях кісткового мозку за умов дії опромінення щодобовою дозою 0,258 мКл/кг у динаміці експерименту (М±м, n=6).
Клітинні популяції | Номер електрофоретичних фракцій | Норма | Доба | ||
10 | 20 | 30 | |||
Еритроїдна | 1 | 17.23±2.60 | 21.3±1.1 | 20.25±3.65 | 18.45±2.7 |
2 | 59.43±3.17 | 50.35±7.0 | 46.3±2.44* | 56.6±5.8 | |
3 | 17.8±2.76 | 21.63±2.48 | 30.53±5.6* | 23.92±4.6 | |
4 | 4.75±0.65 | - | - | - | |
Мієлоїдна | 1 | 17.98±2.87 | 25.05±4.05 | 46.7±3.8* | 23.65±2.8 |
2 | 52.72±5.23 | 49.15±3.1 | 29.8±2.5* | 57.63±4.5 | |
2** | - | 7.7±0.3 | - | - | |
3** | 5.78±0.8 | - | - | - | |
3 | 17.52±3.06 | 22.85±2.9 | 21.6±4.3 | 18.72±2.12 | |
4 | 5.48±0.85 | - | - | - | |
*- Відмінність між контрольними та дослідними результатами вірогідна, р<0,05
**- Додаткові електрофоретичні компоненти, розташовані поблизу основних фракцій.
збільшенням умісту ізоформи IY (глюкокінази). Ці дані пояснюють виявлене раніше зниження загальної питомої активності ГК у процесі опромінення в мієлоїдних клітинах у термінальні строки. Відомо, що у глюкокінази Км є значно більшою порівняно з іншими ізозимами ГК,а питома активність-меншою, низька спорідненість до глюкози [7]. Понижена експресія ГК-II простежувалась за умов інсулін-незалежного діабету [12]. Можна припустити, що виявлений перерозподіл ізозимного складу ГК і Г-6-ФДГ в еритроїдній та мієлоїдній фракціях за умов іонізуючого випромінювання
пов¢язаний зі змінами в регуляції експресії генів відповідних ізоферментів при радіаційному стресі.
Таблиця 3
Відносна ферментативна активність (%) ізоформ гексокінази в еритроїдній і мієлоїдній популяціях кісткового мозку білих щурів у процесі опромінення в щодобовій дозі 0,258 мКл/кл (М±м, n=5)
Популяції кісткового мозку | Варіанти досліду | Номер електрофоретичних фракцій | |||
1 | 2 | 3 | 4 | ||
Еритроїдна | Норма | 6,50±1,00 | 53,65±1,15 | 16,90±1,60 | 22,98±2,43 |
10 доба | 5,30±1,21 | 56,43±1,26 | 12,07±1,04* | 26,20±1,07 | |
20 доба | 19,97±5,09 | 46,37±5,28 | 13,80±1,75 | 20,83±3,33 | |
30 доба | 8,50±1,50 | 46,50±4,50 | 15,40±1,50 | 29,60±4,90 | |
Мієлоїдна | Норма | 5,85±0,85 | 50,95±0,35 | 9,90±0,10 | 33,30±1,10 |
10 доба | 1,40±0,20* | 54,00±1,22 | 19,96±4,64 | 25,16±6,30 | |
20 доба | 1,20±0,20* | 38,10±2,00* | 11,60±2,20 | 49,10±1,00* | |
30 доба | 2,56±0,43* | 41,60±4,55* | 14,03±2,95 | 41,80±7,90 | |
*- Відмінність між контрольними та дослідними результатами вірогідна, р < 0,05.
Отже, реакція різних клітинних популяцій кісткового мозку на дію іонізуючої радіації є певною мірою специфічною, що може бути пов¢язано з особливостями метаболізму у червоному та білому ростках.
____________________
1. Бурлакова Е.Б., Голощанов А.Н., Горбунова Н.В., и др. Особенности биологического действия малых доз облучения // Радиац.биология. Радиоэкология. 1996. Т.36. Вып.4. С.389-412.
2. Великий М.М., Верніковська Я.І., Старикович Л.С. та ін. Дослідження впливу вітаміну Д3 на метаболічні процеси в еритроциті щурів при дії екстремальних факторів // Укр.біохім.журн. 1999. Т.71. №6. С.17-22.
3. Великий Н.Н., Старикович Л.С., Коробов В.Н. и др. Влияние хронического рентгеновского излучения на метаболизм и функционирование эритроцитов // Радиац.биология.Радиоэкология.1999.Т.39.С.427-432.
4. Гераскин С.А. Закономерность формирования цитогенетических эффектов малых доз ионизирующего излучения // Матер .III съезда по радиационным исследованиям. Пущино,1997.Т. 1.С.20-27.
5. Корочкин Л.И., Серов О.Л., Пудовкин А.И. и др. Генетика изоферментов.М.,1977.
6. Наследственные анемии и гемоглобинопатии // Под ред. Ю.Н.Токарева и др. М.,1983.
7. Петрунь Н.М., Громашевская Л.Л., Фетисова Т.В. и др. Изоферменты в медицине. К., 1982.
8. Рождественский Л.М., Конрадов А.А. Концепция действия пролонгированной ионизирующей радиации низкой интенсивности как раздражающего, а не повреждающего фактора // Матер. III съезда по радиационным исследованиям. Пущино, 1997. Т.I. С.39-40.
9. Сибирная Н.А., Сухомлинов Б.Ф., Хмиль М.В. Метод фракционирования клеток костного мозга в градиенте смесей фикола и верографина // Лаб.дело.1991.№4.С.24-25.
10. Снитковский Д.М. Биологические события, инициируемые малыми дозами радиации с низкими ЛПРЭ, обусловленные программируемыми реакциями клеток // Матер.III съезда по радиационным исследованиям. Пущино.,1997.Т.1.С.44.
11. Черкасова Л.С., Миронова Г.М. Влияние ионизирующей радиации на ферменты углеводного обмена // Радиобиология.1976.Т.10.№3.С.657-668.
12. Braitmait S..S., Palazuk B., Colca J. R.., et al. Reduced expression of hexokinase II in insulin-resistant diabetes // Diabetol.1995.Vol.44.№1.P.43-48.
13. Kahn A., Vibert M., Cottean D. et al. Hyperanodic forms of human glucose-6- phosphatedehydrogenase // Biochim. et Biophys. Acta. 1978. Vol.526. P.318-327.
14. Sebastian S., Hoelee B., Hande M.P. et al. Assingment of hexokinase types 1,2,3 (Hk 1,2,3) and glucokinase (Gck) to rat chromosome band 20q 11, 4q34, 17q12 and 14q21 respectively, by in situ hybridization // Cytogen.& Cell.Gen.1997.Vol.77.№3-4.P.266-267.
15. Streffer C., Tanooka H. Biological effects after small radiation doses // Int.J.Radiat.Biol. 1996. V.69. №2. P.269-272.