ВПЛИВ КАРНОЗИНУ ТА ЙОГО КОМПЛЕКСУ З ЦИНКОМ НА УТВОРЕННЯ ОКСИДУ АЗОТУ В ГОЛОВНОМУ МОЗКУ ЩУРІВ ЗА УМОВ ГІПОКСИЧНОЇ ГІПОКСІЇ

 

М.Бойко, О.Крисько, В.Коробов, А.Федорович, М.Великий

 

Львівський національний університет імені Івана Франка

вул. Грушевського,4, м. Львів 79005 Україна ©

 

Оксид азоту (•NO) – поліфункціональний фізіологічний регулятор біологічних процесів [10]. Його утворення в організмі, крім неферментативного розкладу азотистої кислоти в кислому середовищі, забезпечується ферментативними NO-синтазною та нітритредуктазною системами [3, 8], які об’єднані в єдиний цикл оксиду азоту [7].

У функціонуванні нітритредуктазної ланки циклу оксиду азоту головну роль відіграють гемвмісні білки. Серед них вагоме місце посідають дихальні гемопротеїди – міоглобін та гемоглобін, які у дезоксиформі разом з іншими електронодонорними системами беруть активну участь у відновленні іонів NO2- до NO, а також самі можуть бути пастками для оксиду азоту.

Ми дослідили, що м’язовий дипептид карнозин, широко відомий як антиоксидант і мембранопротектор, може регулювати RT перехід в молекулі нітрозогемоглобіну, що сприятиме дисоціації оксиду азоту від Hb-NO та посилюватиме його нітритредуктазні властивості [4]. Таким чином карнозин через гемоглобін регулюватиме концентрацію оксиду азоту в організмі ссавців.

Щоб відповісти на запитання чи виявлений ефект карнозину є специфічний за умов гемічної гіпоксії, чи універсальний для інших гіпоксичних станів, ми застосували модель гострої гіпоксичної гіпоксії. Об’єктом досліджень був головний мозок – тканина, яка для метаболічних процесів використовує більше ніж половину спожитого організмом кисню, а також містить потужну NO-синтазну систему. Вивчали вплив карнозину і його комплексу з цинком на утворення оксиду азоту за його метаболітами – нітрит- та нітрат-іонами.

Експерименти виконували на статевозрілих білих безпородних щурах-самцях масою 180-220 г. Тварин попередньо тестували на стійкість до гострої гіпоксії, піднімаючи на висоту 11,5 тис. м (час виживання у високорезистентної групи у 5,3 раза більший, ніж у низькорезистентної) [1]. Досліджували тварини низькорезистентної групи. Водні розчини карнозину і Zn-карнозину вводили внутрішньочеревно дозами 20 та 10 мг на 1кг маси тварини відповідно за 30 хвилин до гіпоксичної гіпоксії та за 1 год до декапітації. Гіпоксичну гіпоксію створювали в барокамері з парціальним тиском кисню 170 мм рт.ст., що відповідає висоті 11000 м

над рівнем моря (н.р.м.) протягом 30 хв. Після декапітації видалений головний мозок промивали у льодяному 20 мкМ ТRIS-HCl буфері (pH 7.4) і заморожували в рідкому азоті. Екстракт мозку готували з використанням цього ж буферу у співвідношенні буфер : тканина = 3 : 1. Депротеїнізацію екстракту мозку виконували 0.3н. розчином NaOH та 5% розчином ZnSO4. Концентрацію нітрит- та нітрат-іонів визначали спектрофотометрично за методиками [14] та [11] відповідно, лактату і пірувату за методом Хохорста та Цока і Лампрехта відповідно [13].

Відомо, що гостра гіпоксична гіпоксія призводить до збільшення вмісту NO2--іонів у різних тканинах ссавців [5]. В наших експериментах цей показник зростав майже вдвічі і сягав 80,667 ± 2,061 нмоль на г тканини у головному мозку щурів, які перебували 30 хвилин у барокамері з рО2 = 170 мм рт.ст. порівняно з інтактними тваринами (40,560 ± 1,356 нмоль на г тканини) (рис.1).

Введення щурам розчинів карнозину і Zn-карнозину перед гіпоксією призводило до достовірного зниження концентрації NO2--іонів до 15,304 ± 1,307 та 14, 666 ± 1,368 нмоль на г тканини відповідно порівняно з гіпоксією. Після введення тваринам розчину карнозину концентрація нітрит-іонів знижувалася до 44,000 ± 0,699 нмоль на г тканини порівняно з контролем. Достовірне зниження концентрації NO2--іонів унаслідок  введення   Zn-карнозину  свідчить  про   ефективну   дію   цього

препарату порівняно з карнозином, і може бути пов’язане, з одного боку, із захистом від дії карнозиназ, а з другого - із здатністю іонів цинку інгібувати NO-синтазу за неконкурентним механізмом по відношенню до аргініну і тетрагідробіоптерину [6].

Виявлені ефекти зниження концентрації NO2--іонів у мозку щурів, яким перед гіпоксичною гіпоксією вводили карнозин і Zn-карнозин, мають важливе значення у захисті нейронів від загибелі при дії окислювального стресу. Одержані результати свідчать про участь карнозину в регуляції NO-залежних процесів в організмі ссавців. Зокрема, в умовах гіпоксії концентрація NO3--іонів достовірно зростала до 27,067 ± 0,645 мкмоль на г тканини порівняно з контролем (23,989 ± 1,233 мкмоль на г тканини) (рис. 2).

 

           Після введення розчинів карнозину і Zn-карнозину перед гіпоксичною гіпоксією концентрація NO3--іонів достовірно знижувалася до 19,479 ± 2,062 і 22,967 ± 0,287 мкмоль на г тканини відповідно порівняно з гіпоксією.

 

Виявили, що в умовах гіпоксії співвідношення концентрацій       [NO2-] / [NO3-] = 2,98 значно перевищують величину цього показника в контролі (інтактні тварини): [NO2-] / [NO3-] = 1,69. Це свідчить про те, що в ряду перетворень L-Arg®NO®NO2-®NO3- рівновага зсунута в бік утворення NO2--іонів. Пул NO2--іонів може поповнюватися за рахунок утворення їх в NO-синтазній та нітритредуктазній реакціях.

Значне зниження концентрації NO3--іонів за умов гіпоксії може бути обумовлене викликаною ацидозом активацією нітратредуктаз (наприклад, молібденвмісних білків типу ферментативного комплексу ксантиноксидаза / ксантиндегідрогеназа) і відновленням NO3--іонів до NO2--іонів [6]. Про глибину ацидотичного зсуву в мозку за умов гіпоксії свідчить зростання вмісту молочної кислоти до 2,39 ± 0,24 мкмоль на г тканини порівняно з контролем (1,51 ± 0,13 мкмоль на г тканини). Цікаво, що карнозин і ще більше Zn-карнозин достовірно знижували концентрацію лактату до 1,42 ± 0,21 та 1,34 ± 0,19 мкмоль на г тканини відповідно унаслідок введення їх перед гіпоксією порівняно з контролем.

Виявлені ефекти демонструють здатність карнозину і Zn-карнозину зв’язувати протони, концентрація яких зростає за умов гіпоксії (pH-буферні властивості дипептиду, відкриті академіком Сєвєріним у 1953 р. на працюючому м’язі жаби) [9]:

Глюкоза ® 2 СН3-СНОН ® СОО- + 2Н+

2Н+ + 2 карнозин ® 2 (карнозин×Н+)

Відновлення концентрації Н+ до фізіологічних значень за участю карнозину і Zn-карнозину має важливе значення для регуляції функціонування ферментів-нітратредуктаз та неферментативного утворення NO за умов ацидозу.

При введенні карнозину та Zn-карнозину перед гіпоксією співвідношення концентрацій [NO2-]/[NO3-] становило 0,79 та 0,64 відповідно і було меншим від такого співвідношення за умов гіпоксії (2,98) без попереднього введення дипептиду і його комплексу з цинком, тобто концентрація NO2- значно зменшувалася порівняно з гіпоксією у разі недостовірного зменшення NO3-. Це може свідчити про активацію нітритредуктазних систем під впливом карнозину і Zn-карнозину. Одним із можливих механізмів такої активації може бути взаємодія дипептидів із гемвмісними білками, що мають нітритредуктазні властивості [2]. Можливим є інгібування дипептидами NO-синтази іонами Zn2+ за конкурентним механізмом по відношенню до аргініну і тетрагідробіоптерину, а також імідазолом гістидину за неконкурентним механізмом [12].

Отже, виявлені ефекти зменшення концентрації NO3-- та NO2--іонів у головному мозку щурів за умов введення карнозину і Zn-карнозину перед гіпоксичною гіпоксією свідчить про захисний ефект дипептиду та його комплексу з цинком від нейротоксичної дії NO у процесі його надмірного утворення за умов гіпоксії. Дія комплексного препарату карнозину з цинком є ефективнішою порівняно з карнозином. Припускаємо, що можливими механізмами дії дипептидів можуть бути: вплив на функціонування нітритредуктазних систем унаслідок безпосередньої взаємодії з гемвмісними білками або інгібування NO-синтазної ланки циклу оксиду азоту.

 

 

 

____________________

 

1.     Березовский В.Я. Риси індивідуальності в реакції на гіпоксію // Фізіол. журн.-1975.-Т. 21, № 3. С.371-376.

2.     Бойко М.М., Крисько О.М., Федорович А.М., Коробов В.М. Вплив карнозину на фізико-хімічні властивості гемоглобіну // Експерим. та клін. фізіологія і біохімія. 1999. № 3. С.30-34.

3.     Горрен А.К.Ф., Майер Б. Универсальная и комплексная энзимология синтазы оксида азота // Биохимия. 1998. Т. 63, Вып. 7. С.870-880.

4.     Коробов В.М., Крисько О.М., Бойко М.М., та ін. Вплив карнозину на утворення комплексів гемоглобіну з оксидом азоту у крові щурів при нітритній інтоксикації // Наук. записки Тернопільського державного педагогічного університету ім. В. Гнатюка. Серія: Хімія. 1999. Вип. 3. С.56-60.

5.     Манухина Е.Б., Малышев И.Ю., Смирин Б.В., и др. Продукция и депонирование оксида азота при адаптации к гипоксии // Изв. РАН. Сер. биол. 1999. № 2. С.211-215.

6.     Реутов В.П. Биохимическое предопределение NO-синтазной и нитритредуктазной компонент цикла оксида азота // Биохимия. 1999. Т. 64, Вып. 5. С.634-651.

7.     Реутов В.П. Цикл окиси азота в организме млекопитающих // Успехи биол. химии. 1995. № 35. С.189-228.

8.     Реутов В.П., Сорокина Е.Г. NO-синтазная и нитритредуктазная компонетны цикла оксида азота // Биохимия. 1998. Т. 63, Вып. 7. С.1029-1040.

9.     Северин С.Е. Открытие карнозина и анзерина. Некоторые свойства // Биохимия. 1992. Т. 57, Вып. 9. С.1285-1295.

10.  Снайдер С.Х., Бредт Д.С. Биологическая роль окиси азота // В мире науки. 1992. №7. С.16-24.

11.  Cawse P.A. The determination of nitrate in soil solutions by ultraviolet spectroscopy // Analyst. 1967. № 92. P.311-315.

12.  Gorren A.C.F., Schrammel A., Schmidt K., Mayer B. Thiols and neuronal nitric oxide synthase: complex formation, competitive, inhibition and enzyme stabilization // Biochemistry. 1997. V. 36, №8. P.4360-4366.

13.  Methods of enzymatic analysis / Ed.H.H.Bergmeuer. London. 1974. Vol.1.4. 1487 p.

14.  Myers P.R., Guerra R.Jr., Harrison D.J. Release of NO and EDRF from cultured bovine aortic endothelial cells // Am. J. Physiol. 1990. V. 256. P.1030-1037.