Генетична нестабільність ліній lozenge Drosophila melanogaster

Я. Бобак, Я. Черник

Львівський національний університет імені Івана Франка

вул.Грушевського 4, м.Львів, 79005 Україна

Проблема генетичної нестабільності є однією з центральних у вивченні спонтанного мутаційного процесу. Відкриття та дослідження мобільних генетичних елеменів (МГЕ) дало змогу вияснити, що важливою причиною спонтанних мутацій у Drosophila melanogaster є транспозиції МГЕ, а нестабільність окремих генів є фенотиповим проявом цих процесів [5, 6]. Отже, видимі нестабільні мутації можна розглядати як фенотипові маркери інсерцій та ексцизій рухомих елементів геному, з огляду на це у дослідженнях властивостей та механізмів дії МГЕ можна застосовувати методи класичної генетики. Деякі автори [2, 7, 9] виконали детальний аналіз природи багатьох нестабільних алелів та нестабільних систем у D. melanogaster застосовуючи молекулярно-генетичні методи. Матеріалом для досліджень були, у більшості випадків, нестабільні індуковані мутації. Моніторинг природних популяцій дав змогу виділити та описати нестабільні мутації природного походженя. Дослідження цих мутацій має важливе значення для розуміння закономірностей природного мутаційного процесу, місця та ролі в ньому МГЕ та механізмів регуляції індукованої ними генетичної нестабільності. Природні нестабільні алелі виявлені для цілого ряду генів, але найбільш повно генетичні властивості описані для локусів singed та yellow [3, 4]. Цікавим та маловивченим у цьому плані є складний локус lozenge (lz; 1-27.7). Метою нашої роботи було дослідити спонтанну мутабільність локусу lozenge залежно від його алельного стану та генетичного оточення.

У роботі використовували лінії lozenge D. melanogaster – похідні від генетично нестабільної лінії lz^75V, виділеної з природної популяції Далекого Сходу [8]. Волошина зі співавторами [1] методом гібридизції in situ на політенних хромосомах дослідили, що нестабільність цієї лінії зумовлена активністю мобільного Р‑елементу, інсерція якого виявлена в районі 8D1-2 Х‑хромосоми, де міститься локус lz. Облік видимих мутацій у локусах Х‑хромосоми провели методом зчеплених Х‑хромосом. Самців досліджуваних ліній lozenge схрещували індивідуально з самками C(1)DX, ywf /Y, а частоту появи мутантів визначали як співвідношення мутантних самців до загальної кількості самців-потомків.

Досліджені лінії поділяли на чотири фенотипові класи, наведені в порядку підсилення фенотипового прояву: lz⁺, lz^sl, lz^75V та lz^ex [1]. До кожного з класів відносився ряд алелів, який виник у процесі експериментів (табл. 1). Незважаючи на морфологічну подібність, до одного класу були віднесені алелі, які розрізнялися за такими показниками, як стабільність, напрям мутування, фертильність самок, активність фенолоксидази, взаємодія з іншими генами та ін. Все це свідчило про значну генетичну гетерогенність досліджених ліній.

Результати аналізу частоти виникнення спонтанних мутантів дали змогу розділити досліджені лінії на дві групи: стабільні та нестабільні, відмінності між якими були тісно пов’язані з фенотиповим проявом алелю lz (табл. 1). Генетично стабільними виявилися лінії з фенотипом lz⁺ і лінії з максимальним вираженням гена lz - lz^ex. Серед потомків цієї групи ліній не було виявлено жодного мутаційного переходу по гену lz, що зумовлене, очевидно, втратою Р-елемента. Нечисленні мутаційні події відбувалися за межами локусу lz.

Таблиця 1

Частота виникнення спонтанних мутантів у ліній lozenge D. melanogaster

Лінія	Кількість проаналізованих самців	Мутанти			Соматичні мозаїки
		Фенотип	Кількість	%	Фенотип	Кількість	%
lz^+2^L	3916	rou	1	0.026	rou	3	0.077
lz^+6L b	2404		0			0
y ct lz^+7L	14093		0			0
lz^sl.2L	2298	lz^n, lz^B	78	3.394		0
y ct lz^sl.2L	10286	lz^+, lz^n, lz^75V, lz^ex	14	0.136		0
lz^sl.1Lv f	1823	lz^+	1	0.055	rou	1	0.055
lz^75V	6862	lz^sl, lz^ss	10	0.146		0
lz^75Vv f	1015	lz^+, w^a	6	0.591	lz^ex	1	0.099
lz^75V.1L	18283	lz^+, lz^n, lz^ss, lz^ex	90	0.492		0
y lz^75V.1L	10351	lz^+, w	4	0.039	lz^ss	2	0.019
lz^75V.1L b	15044	lz^+, lz^sl, lz^ex	201	1.336		0
lz^ex.1L	4895		0			0
y lz^ex.1L	5353		0			0
lz^ex.1L b	3980		0			0

t^* при p³0.95

До другої групи належали лінії з нестабільними алелями lz^sl та lz^75V; вони відрізнялися не лише за рівнем, але й за напрямом мутування. Спектр нестабільних алелів одного фенотипового класу міг мати суттєві відмінності (табл. 1). Кожен алель мав певний спектр мутування, причому, у більшості випадків, існував один переважаючий напрям, за яким мутування відбувалося значно частіше. Для більшості алелів це були мутаційні переходи до lz⁺. Отримані нами мутанти були віднесені до всіх шести фенотипових класів алелів lozenge згідно з класифікацією Волошиної [1]. Описаний також новий алель, позначений нами як lz^ss (lozenge super strong), який за фенотипом близький до lz^ex, однак відрізнявся від нього темно-червоним кольором ока. Як і у випадку вихідних ліній, стабільність виділених мутантів залежала від фенотипу: алелі lz⁺ та lz^ex були стабільними, а представники інших фенотипових класів мали певний підвищений рівень мутування. Однією з характерних рис мутагенезу у групи ліній lz^sl та lz^75V була його локусоспецифічність: переважна більшість мутацій виникала в локусі lz, а також з низькою частотою виявлялись мутації за геном white. Крім генеративних мутантів, серед потомків досліджених ліній виявили декілька соматичних мозаїків (мутації в генах rou та lz). Частота виникнення мутацій у соматичних клітинах була низькою і не залежала від алельного стану гена lozenge (табл. 1).

З метою вивчення впливу аутосом на нестабільність алелю lz^75V.1L (88.5) виконували заміну другої хромосоми на хромосому лабораторної лінії black. Частота виникнення мутантів у отриманої лінії lz^75V.1L b різко зросла, що свідчило про вплив на мутабільність досліджуваного алелю генетичних елементів другої хромосоми лінії black. Спектр мутацій у цьому разі залишався незмінним. Однак у стабільних ліній lz⁺ та lz^ex заміна другої хромосоми не приводила до зміни рівня мутабільності (табл. 1).

Для того, щоб визначити, наявні чи відсутні такі регуляторні елементи в Х‑хромосомі, було проаналізовано ряд ліній lz, отриманих у результаті рекомбінаційних замін ділянки Х^75V‑хромосоми на ділянки Х-хромосоми лабораторних ліній yellow та y ct v f. У першому експерименті отримали рекомбінантну хромосому, в якої дистальна від гена lozenge ділянка Х-хромосоми лінії (88.5) з алелем lz^75V.1L була замінена ділянкою Х-хромосоми лінії yellow. У лінії y lz^75V.1L з цією рекомбінантною хромосомою простежували суттєве порівняно з вихідною лінією lz^75V.1L зниження частоти мутування зі зміною та звуженням спектра мутацій. Аналогічні результати отримали, аналізуючи інший алель lz^sl.2L. В одержаної шляхом рекомбінації з лінією y ct v f лінії y ct lz^sl.2L теж спостерігалося зниження частоти мутування гена lozenge, однак спектр мутацій був ширшим. Оскільки в отриманих ліній була виконана заміна аутосом на аутосоми лабораторної лінії C(1)DX, y w f, ми виявили, що аутосоми не впливають на зниження мутабільності гена lozenge. Однак у дистальній частині Х^75V–хромосоми наявні чинники, необхідні для підтримання нестабільного стану, тому що їхня елімінація шляхом рекомбінації суттєво знижує мутабільність нестабільних алелів - похідних lz^75V.

З метою дослідження взаємозв’язку мутування гена lz та інших генетично нестабільних локусів Х-хромосоми під час наступних експериментів в дистальну частину Х-хромосоми лінії lz^75V.1L (88.5) шляхом рекомбінації були введені ділянки хромосом нестабільних ліній sn^ex lz⁺(88.24) та y² w^a4 (377). Синтезовані лінії sn^ex lz^75V.1L та y² w^a4 sn^+3L lz^75V.1L у Х-хромосомі містили два або чотири генетично нестабільні алелі з інсерціями різних МГЕ: yellow - з мдг4, white – з соріа (bell), singed – з мдг3, lozenge - з Р-елементом. Для всіх цих ліній був характерний певний рівень нестабільності, причому мутації відбувалися в різних локусах з різною частотою як в генеративних, так і в соматичних клітинах (табл. 2). Частота мутаційних подій у гені lz залежала як від його алельного стану, так і від одночасної наявності в геномі інших нестабільних локусів. Нестабільними у цих лініях залишалися алелі lz^75V.1L та lz^sl.4L, серед мутаційних переходів яких переважали

Таблиця 2.

Частота виникнення спонтанних мутантів у ліній D. melanogaster з нестабільними локусами Х-хромосоми

Лінія		Кількість проаналізованих самців	Мутанти			t	Соматичні мозаїки			t
			Фенотип	Кіль-кість	%		Фенотип	Кіль-кість	%
lz^75^V^.1^L	(88.5)	18283	lz^+, lz^sl, lz^ss, lz^ex	90	0.492			0
sn^+1L lz^+8L	(91S2)	3437	sn^ex	3	0.087	-3.336^*	sn^ex,sn^f, sc	87	2.531	21.556^*
cm^1Lsn^+3Llz^+9L	(92S2)	2358	sn^ex	13	0.551	0.383	sn^ex,sc	70	2.969	23.337^*
sn^ex lz^sl.4L	(91R16)	2516	lz^+, sn^+	2	0.080	-2.925^*	sn^+	1	0.040	2.696^*
sn^ex lz^75V.1L	(91.1)	2080	lz^+, lz^sl,sn^+	10	0.481	-0.071		0
cm^1L sn^ex lz^75V.1L	(91R7)	2109	lz^+, lz^ex, sn^+, cm^+,lz^+cm^+	26	1.233	4.282^*	sn^+	2	0.095	4.164^*
sn^f.1Llz^75V.1L	(91R24)	1757	lz^+,lz^sl, sn^+, lz^+sc^1	29	1.651	6.036^*	sc	8	0.455	9.126^*
cm^1Lsn^+3L lz^75V.1L	(92S1)	4155	lz^+, lz^sl,sn^f	62	1.492	7.093^*	sn^ex,sn^f, lz^+, lz^ex,sc	89	2.142	19.829^*
y^1w^a4sn^+3L lz^+11L	(96S18)	1110	sn^f	1	0.090	-2.677^*	sn^ex, sn^f, sc	42	3.784	26.330^*
y^2w^a4sn^+3L lz^+10L	(958S1)	1988	w^pL	12	0.604	0.666	sn^ex	75	3.773	26.312^*
y^2w^a4sn^+3Llz^75V.1L	(95.8)	1828	lz^+,lz^sl,sn^ex	12	0.656	0.942	sn^ex,sn^f	67	3.665	25.930^*
y^2w^a4sn^ex1Llz^75V.1L	(96S7)	1018	lz^+	5	0.491	0.005	sn^+	1	0.098	4.238^*

t^* при p³0.9

реверсії до норми – lz⁺. Виявлено також достовірне зростання рівня мутування алелю lz^75V.1L при наявності алелів cm і sn^f.

Досліджуючи інші гени у цих ліній, виявили, що найчастіше мутації виникали в локусі sn (табл.2). Для алелів sn^ex та sn^f.1L були властиві реверсії до sn⁺. Алель sn⁺, який фенотипово не відрізнявся від норми, мав високий рівень нестабільності в генеративних і соматичних клітинах, мутуючи до sn^ex та sn^f.

Мутаційні переходи в генах yellow і white були проаналізовані в одержаної шляхом рекомбінації лінії y² w^a4 sn^+3L lz^75V.1L та її похідних. Незважаючи на те, що ці гени були внесені в нову генетичну конструкцію від стабільної лабораторної лінії y² w^a4, з певною частотою простежували мутаційні переходи y² ® y¹, w^a4® w^pL.

Виникнення нових алелів і збереження у цьому разі генетичної нестабільності, а також відома роль Р-елемента в цих процесах, дали змогу зробити припущення про переміщення цього МГЕ в нові сублокуси гена lozenge. Для перевірки цього припущення було взято по одному алелю кожного фенотипового класу й отримано компаунди від схрещування цих ліній між собою та з лабораторними лініями lz^50e30 і lz. Тест на комплементацію виявив, що всі досліджені алелі належали до однієї групи комплементації, тобто всі мутаційні події відбуваються в одному сублокусі гена lozenge, оскільки різні сублокуси цього гена комплементували між собою. Комплементація з лініями lz^50e30 (сублокус spectacle) і lz (сублокус lozenge) свідчила про те, що похідні від lz^75V алелі, найбільш вірогідно, належали до сублокусу glossy складного локусу lozenge.

Пов’язуючи нестабільність досліджуваних ліній з активністю Р‑елемента в локусі lozenge, логічно було припустити, що мутації, які виникали de novo, були наслідком Р – М гібридного дисгенезу. Аналізуючи результати схрещування з лінією p₂ (сильна Р лінія), виявили, що лінія з алелем lz^75V.1L поводить себе, як М-лінія, виявляючи високий рівень стерильності при 25^оС і статистично достовірне зростання цього показника при 29^оС (табл. 3). У гібридних самок, які несли Х-хромосому з алелем lz^75V.1L від нестабільних ліній lz^75V.1L, y lz^75V.1L та sn^ex lz^75V.1L у компаунді з Х‑хромосомою М-лінії y ct v f, теж виявлено високий (90% і вище) відсоток стерильності вже при 25^оС, що свідчило про відсутність проявів класичного Р-М гібридного дисгенезу.

Таблиця 3

Визначення цитотипу у ліній з різним алельним станом гена lozenge

Г і б ри д н і с а м к и	Стерильність в F1, %
	25^0С	29^0С
lz^75^V^.1^L (88.5) / p2 (P)^* / y ct v f (M)^*	40.58 98.55	68.66 100.00
y lz^75V.1L(89.1) / y ct v f (M)^*	100.00	100.00
sn^ex lz^75V.1L (91.1) / y ct v f (M)^*	98.63	-
lz^+2L(88.6) / y ct v f (M)^*	4.07	13.79
lz^ex.1L(88.14) / y ct v f (M)^*	5.83	16.23

^*Цитотип використаних у схрещуваннях лабораторних ліній

Отже, у всіх проаналізованих ліній lz у процесі дослідження як генеративних мутантів, так і соматичних мозаїків виявлено високу локусоспецифічність мутаційних подій; мутації відбувалися, у більшості випадків, у нестабільних локусах, які містили інсерції МГЕ. З найвищою частотою прстежували мутаційні переходи в гені lozenge, у цьому разі частота мутування гена значною мірою залежала від генетичного оточення. Всі мутаційні події в гені lz відбувалися в одній групі комплементації - сублокусі glossy. Виявлено, що виникнення соматичних мозаїків було пов’язане, головно, з мутаціями в гені sn; найчастіше мозаїки фіксувалися у потомстві ліній, які несли алель sn⁺.

____________________

1. Волошина М.А., Голубовский М.Д., Павлова М.Б., Беляева Е. Сп. Влияние генетического фона на частоту мутирования инсерционных алелей гена lozenge у Drosophila melanogaster // Генетика. 1996. Т. 32. №5. С.641-648.

2. Гергиев П.Г., Елагин В.А., Буфф У.М. Супернестабильные мутации в локусе yellow у Drosophila melanogaster // Генетика. 1992. Т. 28. №4. С. 947-960.

3. Голубовский М.Д., Беляева Е.С. Вспышка мутаций в природе и мобильные генетические элементы: изучение серии аллелей локуса singed у Drosophila melanogaster// Генетика. 1985. Т. 21. №10. С. 1662-1670.

4. Голубовский М.Д., Захаров И.К.,Соколова О.А. Анализ нестабильности алелей гена yellow, выделенных из природных популяций дрозофилы в период вспышки мутабильности // Генетика. 1987. Т. 23. №23. С. 1595-1603.

5. Ильин Ю.В. Мобильные диспергированные гены эукариот. М., 1982., Итоги науки и техники. Т.18. Сер. мол. биол.

6. Хесин Р.Б. Непостоянство генома. М., Наука, 1984.

7. Charlesworth B., Langley C.H. The population genetics of Drosophila transposable elements // Ann. Rev. Genet. 1989. Vol.23. P.251-287.

8. Golubovsky M.D. Unstable lozenge and fine bristle mutation from Far East population // Drosophila Inform. Serv. 1978. Vol. 53. P.122.

9. Smith P.A., Corces V.G. Drosophila transposable elements: mechanisms of mutagenesis and interactions with the host genome // Advances in Genetics. 1991. Vol.29. P.229-299.