Отримання і характеристика стрептоміцин-резистентних мутантів продуцента протипухлинного антибіотика ландоміцину Е Streptomyces globisporus 3-1

О.Громико, Л.Басілія, Н.Кириченко, В.Федоренко

Львівський національний університет імені Івана Франка

вул.Грушевського,4, 79005 Львів, Україна

Актиноміцети роду Streptomyces викликають особливий інтерес, зумовлений їхньою здатністю синтезувати широкий спектр антибіотиків [6, 10, 2]. Функціонування генів стійкості штамів-продуцентів до власного та інших антибіотиків може значно впливати на рівень їхньої антибіотичної активності [5]. Хоча багато публікацій присвячено механізмам ініціації вторинного метаболізму, зокрема біосинтезу антибіотиків, лише деякі з них сконцентрувались на ролі трансляційного апарату в цьому процесі [6, 7]. Важливим підходом для вивчення цієї проблеми є отримання мутацій стійкості до антибіотиків, зокрема тих, які впливають на процеси транскрипції і трансляції. Плейотропний ефект на біосинтез антибіотиків характений для мутацій резистентності актиноміцетів до аміноглікозидних, макролідних антибіотиків, хлорамфеніколу, рифампіцину і тетрацикліну [4, 9, 12, 11, 8].

Об'єктом нашої роботи була культура Streptomyces globisporus 3-1, яка є продуцентом ландоміцину Е - антибіотика ангуциклінової групи, що має протипухлинну активність [1, 3]. Нашою метою було отримання та вивчення колекції стрептоміцинрезистентних (Str^r) мутантів S.globisporus 3-1 та визначення впливу мутацій стійкості до стрептоміцину на біосинтез ландоміцину Е.

Штам S. globisporus 3-1 отриманий від проф.Б.П.Мацелюха (Інститут мікробіології та вірусології ім.Д.К.Заболотного НАН України, м.Київ). Str^r-мутанти зазначеного штаму одержані під час виконання даної роботи. Штами S.globisporus вирощували на кукурудзяному середовищі №7 (КС-7):кукурудзяна мука - 10,0 г; пептон - 2,0 г; NaCl - 2,5 г; агар - 7,5 г; вода дистильована - до 0,5 л; pH 8,5.

Спори штаму S.globisporus 3-1 обробляли УФ-променями з довжиною хвилі 260-280 нм.; джерело УФ-променів - лампа Medicor BLM - 12. Час оброблення коливався від 30 до 40 с. У зазначених умовах виживання спор коливалося від 2,7 до 4,5%. Резистентність штамів S.globisporus до антибіотиків визначали за методикою [4].

Екстракцію ландоміцинів, їх хроматографічне розділення за допомогою тонкошарової хроматографії (ТШХ) на силікагелевих пластинках Silufol UV 254 в системі розчинників хлороформ:метанол (9:1) та ідентифікацію ландоміцинів виконували за методикою [2]. Рівень продукції ландоміцину Е визначали за допомогою калібрувальної кривої, побудованої із застосуванням очищеного препарату ландоміцину Е і фотометра КФК-3.

Штам S.globisporus 3-1 вивчений за ознаками стійкості до антибіотиків. Унаслідок титрування спор штаму на середовищі КС-7 із зростаючими концентраціями антибіотика виявлено, що 50-100% виживання штаму простежується при таких концентраціях антибіотиків: стрептоміцин - < 0,5 мкг/мл; тетрациклін - < 5 мкг/мл; хлорамфенікол - < 3 мкг/мл та еритроміцин - < 1,0 мкг/мл (рис.1).

Рис.1. Залежність виживання спор штаму S.globisporus 3-1 від концентрації стрептоміцину (1), еритроміцину (2), тетрацикліну (3) та хлорамфеніколу в середовищі.

Таблиця 1

Спектр резистентності Str^r-мутантів S. globisporus до антибіотиків

Антибіотик	Конц мкг/ диск	Діаметр зон пригнічення, мм
		3-1	І група		ІІ група			ІІІ група
			S316	S19	S319	S322	S200	S20-1	S312	S315
Олеандоміцин	15	20,7±0,6	24,5±0,7	34,6±0,9	30,2±2,1	30,8±1,3	23,2±0,4	30,0±1,2	29,6±1,3	28,4±1,5
Лінкоміцин	15	15±0,4	0	0	0	0	0	13,3±1,4	14,4±1,8	10,4±1,2
Еритроміцин	15	18±1,3	15,7±1,5	34,7±2,1	22,5±1,2	18,5±1,5	14,1±1,2	19,5±1,8	23,7±1,7	32,3±1,2
Бензилпеніцилін	10	0	0	0	0	0	0	0	0	0
Оксацилін	10	0	0	0	0	0	0	0	0	0
Карбеніцилін	25	0	0	0	0	0	0	0	0	0
Цефалотин	30	0	0	0	0	24,1±1,3	0	0	0	12,1±1,2
Ампіцилін	10	0	10,4±1,7	0	0	12,6±1,7	12,5±0,5	0	0	0
Канаміцин	30	32,1±2,1	35,8±1,8	30,5±1,4	40,3±2,1	42,4±2,2	32,7±1,7	37,5±2,1	35,2±1,9	35,4±1,8
Стрептоміцин	30	28,4±2,1	0	0	30,3±2,7	28,1±1,1	0	30,2±2,4	27,9-±2,1	28,4±1,4
Мономіцин	30	17,3±0,9	22,5±1,7	22,5±1,8	32,1±2,6	30,5±1,8	22,3±0,9	30,2±1,5	29,4±2,1	30,3±1,9
Гентаміцин	10	17,2±0,6	18,3±1,5	24,7±1,7	26,3±1,6	23,6±1,3	19,5±1,9	22,4±1,8	20,1±1,6	26,1±1,3
Хлорамфенікол	30	15,7±0,3	14,2±1,2	25,9±1,7	22,7±1,7	25,2±1,5	15,1±0,4	25,7±1,5	23,3±1,7	20,3±1,6
Ріфампіцин	5	22,4±0,8	28,6±0,7	36,2±2,6	35,3±2,2	40,1±2,7	26,9±1,8	31,3±2,2	33,1±2,2	35,4±2,2
Тетрациклін	30	8,1±0,2	0	0	0	21,7±1,7	14,5±1,7	10,5±0,2	9,6±0,6	0
Поліміксин М	300 од.	0	0	0	0	0	0	0	0	0

Вивчена здатність штаму 3-1 утворювати мутанти, стійкі до стрептоміцину. Ми виявили, що спонтанні стрептоміцин-резистентні мутанти виникають з частотою від 1,0´10^-4 до 4,1´10^-7 на середовищі з концентраціями антибіотика від 1,0 до 2,5мкг/мл. Оброблення УФ-променями призводило до збільшення частоти появи Str^r-мутантів. Зокрема, УФ-індуковані Str^r-мутанти відбиралися на середовищі з 2,5 мкг/мл антибіотика з частотою 0,6´10^-5. У результаті виконаної роботи ми створили колекцію із 162 Str^r-мутантів, властивості яких вивчали.

Рис.2. Залежність виживання спор Str^r-мутантів S.globisporus від концентрації стрептоміцину в середовищі. 1 – штам 3-1; 2 – штам S312; 3- штам S200; 4 – штам S19.

Таблиця 2

Характеристика Str^r-мутантів S.globisporus за рівнем біосинтезу ландоміцину Е

Група мутантів	Рівень стійкості			Кількість ландоміцину Е відносно контролю, %*
				до 100 включно		101-120		121-140		141-210
	мкг/мл	абс. чис.	%	абс. чис.	%	абс. чис.	%	абс. чис.	%	абс. чис.	%
І	100-500	49	30,2	10	20,4	19	18,4	0	0	30	61,2
ІІ	10-50	60	37,0	52	86,7	5	8,3	3	5,0	0	0
ІІІ	2,5-5,0	53	32,8	33	62,3	15	28,3	5	9,4	0	0
ВСЬОГО		162	100,0	95	58,6	39	24,1	8	4,9	30	18,5

* за 100% брали кількість ландоміцину Е, яку синтезує вихідний штам S.globosporus 3-1

На основі методу відбитків, отримані Str^r-мутанти класифікували за рівнями резистентності до стрептоміцину (табл.2). Найвищий рівень резистентності (до 100-500 мкг/мл стрептоміцину в КС-7) мали 15,3% мутантів (І група ). 42,7% мутантів (ІІ група) мали нижчий рівень резистентності - до 10-50 мкг/мл. До ІІІ групи належали низькорезистентні мутанти, стійкі до 2,5-5,0 мкг/мл (37,4%). Титрування спор мутантів - представників кожної з груп Str^r-мутантів - на середовищі із зростаючими концентраціями антибіотика показало, що у низькорезистентного мутанта S312 (III група) простежується лише незначне підвищенням стійкості до стрептоміцину (рис.2); 100% виживання спор у штаму S200 (ІІ група) простежувалося на середовищі з 10 мкг/мл, а штаму S19 (І група) - з 500 мкг/мл стрептоміцину. Фенотипи резистентності цих мутантів зберігалися при пасажах у неселективних умовах. Отже, велика різниця у рівнях стійкості отриманих Str^r-мутантів може бути зумовлена мутаціями в різних генах [7].

За допомогою методу дифузії в агарі вивчали спектр стійкості Str^r-мутантів до антибіотиків різного механізму дії (див. табл.1). У низькорезистентних штамів S20-1, S312 i S315 змін рівня стійкості до аміноглікозидних і b-лактамних антибіотиків не простежували. Виявили, що до мономіцину, олеандоміцину і рифампіцину вони чутливіші, ніж вихідний штам. Штам S315 чутливіший від вихідного ще й до еритроміцину, цефалотину і гентаміцину. Мутанти ІІ групи S319 i S322 чутливіші до мономіцину, канаміцину й олеандоміцину, штам S322 також чутливіший і до цефалотину та ампіциліну. Всі представники І і ІІ груп стійкі до лінкоміцину. Високорезистентний штам S19 значно чутливіший від вихідного штаму до макролідів і рифампіцину.

Ми вивчали рівень біосинтезу ландоміцину Е Str^r-мутантами S.globisporus (табл.2). Виявили, що більшість низькорезистентних мутантів (62,3%) синтезують ландоміцин Е на рівні вихідного штаму або менше. У 28,3% мутантів цієї групи рівень біосинтезу антибіотика перевищує показник штаму 3-1 на 1-20%, а у 9,4% мутантів - на 21-40%.

Серед мутантів ІІ групи найменша частина таких, у яких рівень біосинтезу ландоміцину Е становить 101-140%. Переважна більшість досліджених високорезистентних мутантів (61,2%) синтезує на 41-110% більше ландоміцину Е, ніж вихідний штам. Рівень біосинтезу у 18,4% мутантів зазначеної групи перевищує показник вихідного штаму на 1-20%. Рівень біосинтезу антибіотика у решти мутантів є нижчим або дорівнює штаму 3-1.

Отже, на підставі виконаних досліджень виявили високу мінливість Str^r-мутантів S.globisporus 1912 як за рівнем стійкості до стрептоміцину та інших антибіотиків, так і за рівнем синтезу ландоміцину Е, що свідчить про плейотропний характер мутацій стрептоміцин-резистентності. У більшості вивчених мутантів S.globisporus рівень біосинтезу ландоміцину Е був нижчим порівняно з вихідним штамом. Однак серед високорезистентних Str^r-мутантів простежується значна частина штамів з підвищеним рівнем біосинтезу ландоміцину Е. Подібні результати одержали Ochi зі співавторами, які дослідили мутацію str-6 S.lividans TK24, що зумовлює високий рівень резистентності до стрептоміцину і спричиняє індукцію синтезу актинородину. Ця мутація виникає в гені rpsL, що кодує рибосомальний білок S12 [13].

Отже, результати нашої роботи свідчать про ефективність пошуку штамів з високим рівнем біосинтезу ландоміцину Е серед високорезистентних Str^r-мутантів S.globisporus 3-1.

___________________

1. Мацелюх Б.П., Коновалова Т.А., Поліщук Л.В. Бамбура О.І. Чутливість до ландоміцинів А і Е стрептоміцетів - продуцентів полікетидних антибіотиків // Мікробіол. журн. 1998. Т.60. №1. C.31-36.

2. Мацелюх Б.П., Лаврінчук В.Я. Одержання і харакетристика мутантів Streptomyces globisporus 1912, дефектних по біосинтезу ландоміцину Е // Мікробіол.журн. 1999. Т.61. №4, С.22-27.

3. Настасяк И.Н., Федоренко В.А., Кириченко Н.В., Даниленко В. Н. Получение и характеристика рифампицинустойчивых мутантов у штамма Streptomyces erytraeus // Антибиот. и химиотер. 1990. Т.35. №12. С. 11-13.

4. Полищук Л.В., Дехтяренко Т.Д., Стефанишин Е.Е. и др. Плазмиды стрептомицетов глобиспориновой группы // Микробиол.журн. 1985. Т.47. №4. С.83-88.

5. Федоренко В.А. Генетические механизмы устойчивости актиномицетов к аминогликозидным антибиотикам // Антибиот. и химиотер. 1999. Т.44. №9. С.29-36.

6. Hesketh A., Ochi K. A novel methods for improving Streptomyces coelicolor A3(2) for production of actinorhodin by introduction of rpsL (Encoding ribosomal protin S12) mutations conferring resistance to streptomycin // J. Antibiot. 1997. Vol.50. N6. P.532-535.

7. Hosoya Y., Okamoto S., Muramatsu H., Ochi K. Acquisition of certain streptomycin-resistant (str) Mutations Enhances Antibiotic Production in Bacteria.- Antimikrobial agents and Chemotherapy. 1998. Vol.42. N8. P.2041-2047.

8. Hosted T., Baltz R. Use of rpsL for dominance selection and gene replacement in Streptomyces roseosporus // J. Bacteriology. 1997. Vol. 179. N1. P.180-186.

9. Moffat.J., Warren T., Lovvet P. The leader peptides of attenuation-regulated chloramphenicol resistance genes inhibit translational termination // J. Bacteriology. 1994. Vol.176. N22. P.7115-7117.

10. Ochi K., Zhang D., Kawamoto S., Hesketh A. Molecular and functional analysis of the ribosomal L11 and S12 protein genes (rplK and rpsL) of Streptomyces coelicolor A3(2) // Mol.Gen.Genet. 1997. Vol.256. P.488-498.

11. Pernodet J., Fish S., Blondeled-Rouault M.-H., Cundliffe E. The Macrolide-Lincosamide-Streptogramin B Resistance Phenotypes characterized by using a specifically deleted, antibiotic-sensivite strain Streptomyces lividans.- Antimikrobial agents and Chemotherapy. 1996. Vol.40. N3. P.581-585.

12. Roberts M. Tetracycline resistance determinants: machanisms of actions, regulation of expresion, genetic mobility, and distribution // FEMS Rviews. 1996. Vol.19. P.1-24.

13. Shima J., Hesketh A., Okamoto S. et al. Induction of Actinorhodin Production by rpsL (Encoding Ribosomal Protein S12) Mutations That Confer Streptomycin Resistance in Streptomyces lividans and Streptomyces coelicolor A3(2) // J. Bacteriol. 1996. Vol.178. N24. P.7276-7284.