ПОШУК ВІКОВИХ ДЕГЕНЕРАТИВНИХ ЗМІН У СТРУКТУРАХ ГОЛОВНОГО МОЗКУ МУТАНТІВ ДРОЗОФІЛИ, ІНДУКОВАНИХ РЕНТГЕНІВСЬКИМ ОПРОМІНЕННЯМ

Н. Я. Кімак

Львівський національний університет імені Івана Франка

вул. Грушевського,4, 79005 Львів, Україна

Проблема старіння і продовження середньої тривалості життя людини є центральною в геронтології, тож закономірно, що до неї неодноразово зверталися як класики (Waismann, 1882; Мечніков, 1901; Богомолець, 1938; McCay, 1941), так і провідні геронтологи сучасності (Harman, 1972-1992; Фролькис, 1970-1992; Walford, 1991 та ін.) [3].

За даними авторів сучасних теорій старіння, цей процес є наслідком первинно виникаючих змін у генетичному апараті клітини; спричинених послабленям активності ферментів репарації, дією вільних радикалів, змінами в нервовій регуляції [9].

Відомо [12, 13], що такі хвороби, як Паркінсона, Альцхаймера, Шаркот-Марі-Туз та інші виявляються у людей старшого віку. Вони супроводжуються змінами в руховій та емоційній сферах, пов^,язаними зі структурними порушеннями нервової системи. Наприклад, демієлінізація нервових волокон спричиняє нейропатію Шаркот-Марі-Туз, яка охоплює гетерогенну групу захворювань, зумовлених мутаціями в мієлінових генах [14] чи мутацією у гені, що кодує білковий компонент шванівських клітин (коннексин 32) [7]. При периферійних нейропатіях спостерігається не лише відсутність мієліну, але і гіпермієлінізація [15].

У працях, присвячених вивченню змін, які виникають у нервовій системі в процесі старіння, головну увагу приділено проблемі вибору об^,єкта дослідження. В генетичному і молекулярному плані доступною системою є Drosophila melanogaster, коротка тривалість життя і простота культивування якої дає змогу застосовувати її як тест-об^,єкт. Виявлено [8, 11], що ряд мутацій дрозофіли, які зумовлюють вікозалежну нейродегенерацію, викликають дефекти в гліальних клітинах.

Ми ставили за мету проаналізувати структури головного мозку в індукованих РО мутантів Drosophila melanogaster у процесі старіння.

У дослідженнях застосовували такі лінії Drosophila melanogaster:

дикий тип Oregon ( контроль);

y²w^a4 (як вихідна лінія з морфологічними маркерами Х-хромосоми);

мутантні лінії, одержані від вихідної внаслідок впливу (РО) сумарними дозами 1000 і 3000 Р і його комплексної дії з деякими хімічними реагентами – РО і нітрозоетилсечовини (НЕС); РО і кофеїну; РО та α-токоферолу (таблиця)

Мутантні лінії, застосовані в роботі ^*

Вид досліду	Генотип	СТЖ^**, дні
Контроль Вихідна лінія РО 1000 Р PO 3000 P HEC PO+HEC PO + кофеїн PO+α-токоферол	Oregon y^2w^a4 y^2w^a4ct y^2wsn (1) y^2w^+Bar y^2wsn (2) y^2w y^2w^x(1) y^2w^x(2) y^2w^x(3) y^2w^x(4) y^2w^x(5) y^2w^a4ct (1) y^2w^a4ct (2) y^2w^+Bar y^2w^x y^2w^a4ct (3) y^2w^a4ct (4) y^2w^a4ct (5) y^2w^a4ct (6)	28 43 33 24 17 32 45 24 27 27 32 29 26 34 30 30 33 39 29

Р>0, 999, t = 30

* white (w) – білі очі; white (w^x) – лимонні очі ; white (w⁺) червоно- коричневі очі;

singed (sn) – опалені щетинки; Bar –смужковидні очі; cut (сt) – обрізаний край крила.

** СТЖ (середня тривалість життя) - термін (дні), протягом якого залишаються живими 50 % імаго.

Дрозофіл утримували в темноті при температурі 25^оС на стандартному поживному середовищі [6]. Культуру синхронізували згідно з Хромими [4].

Досліджували молодих (3-5-денних) і старих (30-денних) мух.

Препарати зрізів мозку дрозофіли виготовляли згідно з Heisenberg [10]. Зрізи фарбували розчинами гематоксиліну й еритрозину [10]. Структури головного мозку аналізували на мікроскопі марки Carl Zeiss.

Фотографія зрізу головного мозку дрозофіли лінії дикого типу Oregon.

Виконуючи попередні дослідження, проаналізували вплив РО сумарними дозами 1000 і 3000 Р, а також у комплексі з деякими хімічними реагентами – НЕС, кофеїном та α-токоферолом - на частоту і спектр появи мутантів у стабільної лабораторної лінії y²w^a4 [1, 5]. У результаті одержали колекцію мутантів (див.таблицю).

Відомо, що РО є універсальним мутагенним фактором, що впливає на всі біологічні об^,єкти. Внаслідок прямої дії РО на генетичний апарат і пошкодження структур молекул ДНК виникають мутації як хромосомного, так і хроматидного типів, які можуть негативно впливати на деякі життєво важливі функції, зумовлюючи скорочення видової тривалості життя. З метою дослідження життєздатності отриманих нами індукованих мутантів побудували криві виживання і проаналізували СТЖ. На підставі аналізу кривих виживання мутантних ліній виявили, що у них дещо знижені показники середньої тривалості життя і менша життєздатність порівняно з вихідною лінією y²w^a4 [2].

Причинами скороченої тривалості життя у дрозофіли можуть бути пошкодження генетичного апарату, які зумовлюють дегенеративні зміни. Kretzschmar et al. [11] дослідили, що у мутантів Swiss cheese (sws) мозкові дефекти виявляються у формуванні у всіх мозкових структурах вакуоль, звідки і походить їхня назва. Вони виявили, що у sws мутантів при різних температурних режимах (18, 25, 29^оС) скорочена тривалість життя порівняно з лінією дикого типу Berlin. Досліджено [10; 11], що ген swiss cheese міститься в Х-хромосомі в районі 7D-1. Припускається, що білок-продукт цього гена відіграє важливу роль у сигнальному механізмі між нейронами та клітинами глії і регулює гліальне обгортання в процесі онтогенезу дрозофіли. Відомо декілька інших мутантів [8; 16], в яких у процесі онтогенезу дегенерація клітин глії спричиняє дегенерацію відповідних нейронів, що призводить до формування вакуоль в окремих структурах головного мозку дрозофіли.

Грунтуючись на літературних даних, ми ставили своїм завданням дослідити структури головного мозку мутантів, наведених в таблиці. Виготовили гістологічні зрізи головного мозку 3-5- денних мух вихідної лінії y²w^a4 і мутантних ліній. Контролем була лінія дикого типу Oregon. На підставі мікроскопічного аналізу цих зрізів не виявили змін у мозкових структурах як вихідної лінії, так і всіх проаналізованих мутантів. Зважаючи на те, що дегенеративні зміни можуть прогресувати в процесі старіння організму, виготовили мозкові зрізи у всіх досліджуваних ліній віком 30 днів. Порушень у структурах головного мозку старих мух теж не виявили (див. рисунок).

Отже, на підставі виконаних досліджень можна стверджувати, що мутантні дефекти в мозку не є причиною зниженої життєздатності і скороченої тривалості життя індукованих радіацією мутантів дрозофіли. Навіть унаслідок дії сильних мутагенних факторів (РО, НЕС) функціонування нервової системи є надійним і забезпечується сильними репаративними і регуляторними системами.

___________________

1. Бобак Я. П., Шоханов С. О., Кімак Н. Я., Черник Я. І. Індукована рентгенівським опроміненням генетична нестабільність по локусах Х-хромосоми у лабораторних ліній Drosophila melanogaster //Актуальні проблеми медицини, біології, ветеринарії і сільського господарства. 1996. Вип.2. C. 78 - 84.

2. Кімак Н. Я., Черник Я. І. Виживання та середня тривалість життя у індукованих рентгенівським опроміненням мутантних ліній Drosophila melanogaster //Актуальні проблеми медицини, біології, ветеринарії і сільського господарства. 1998. Вип. 4. C. 198 - 202.

3. Фролькис В. В. Долголетие: действительное и возможное. К., 1989.

4. Хромых Ю. М. Некоторые методы культивирования дрозофилы в генетическом эксперименте. // Проблемы генетики в исследованиях по дрозофиле. Новосибирск, 1971.

5. Шоханов С.О., Щербата Г.Р., Черник Я.И. Геномная изменчивость лабораторных линий и природных популяций Drosophila melanogaster при действии рентгеновского излучения // Генетика. 1997. Т.33. №1. C. 25-30.

6. Ashburner M. Drosophila. Cold Spring Harbor University Press. NY USA. 1989. Vol. 1.

7. Bergoffen J., Wang S., Scott M.O. et al. Connexin mutations in X-linked Charcot- Marie- Tooth disease // Science. 1993. Vol. 262. P. 2039 - 2042.

8. Coombe P., Heisenberg M. The structural brain mutants Vacuolar medulla of Drosophila melanogaster with specific behavioral defects and cell degeneration in the adult // Journal of Neurogenetics. 1986. Vol. 3. P. 135 - 158.

9. Ferrus A. Neurogenetics of Drosophila // Discussion in Neuroscience. 1992. Vol.9. №1. P. 11-52.

10. Heisenberg M., Bogl K. Isolation of anatomical brain mutants of Drosophila by histological means. Z Naturforsch [ C]. 1979. Vol. 34. P. 143 - 147.

11. Kretzschmar D., Hasan G., Heisenberg M., Benzer S. The Swiss Cheese mutant glial hyperwrapping and brain degeneratoin in Drosophila // The Journal of Neuroscience. 1997. Vol. 17. №19. P. 7425 - 7432.

12. Le Guern E., Sturtz F., Ravise N. et al. Detection of deletion within 17p112 in 7 French families with hereditary to pressure palsies (HNPP) // Cytogenetic Cell Genetics. 1994. Vol. 65. P. 261-264.

13. Mariman E., Jongen P., Gabreels F., Ropers H. H. Genetic and molecular analysis of families with hereditary neuropathy with liability to pressure palsies // Americam Journal of Human Genetics. 1993. Vol. 53. P. 1041 - 1061.

14. Valentijn L. J., Bolhuis P. A., Hensels G. W. et al. The peripheral myelin gene PMP-22/gas-3 is duplicated in Charcot- Marie- Tooth disease type-la // Natural Genetics. 1992. Vol. 1. P. 166 - 170.

15. Verhagen W. M., Joosten EMG., Gabreels FJM., de Graar R. Hereditary neuropathy with liability to pressure palsies - a clinical electroneurophysiological and morphological study // Journal of Neuroscience. 1993. Vol. 116. P. 176 - 184.

16. Xiong W., Montell C. Defective glia induced neuronal apoptosis in the repo visual system of Drosophila // Neuron. 1995. Vol. 14. P. 581-590.