АНАЛІЗ МОРФОЛОГІЧНИХ МУТАНТІВ, ІНДУКОВАНИХ ЕТИЛМЕТАНСУЛЬФОНАТОМ У Drosophila melanogaster

Д. Максимів, Г. Щербата

Львівський національний університет імені Івана Франка

вул.Грушевського, 4 79005 Львів Україна

Вивчення механізмів генетичних процесів можливе за наявності групи мутантів, у яких порушені досліджувані функції. Завдяки молекулярно-генетичним методам велика кількість нових генів була клонована в Drosophila і в інших організмів, однак складним виявилось дослідження in vivo функцій цих генів та їхньої експресії. Плодова мушка D.melanogaster генетично є добре дослідженою, її геном складається приблизно з 5000-10000 різних генів, і значна частина їхніх мутацій (2000-2500) є відомою [Ashburner, Gelbart, 1991]. Однак у багатьох випадках гени, які були клоновані, не відповідають відомим мутаціям. Тому необхідний мутагенез і пошук нових видимих мутацій або тих, які можна виявити завдяки додатковому аналізу (цитологічному, біохімічному або фізіологічному).

Одним із важливих завдань сучасної генетики є отримання мутантів унаслідок впливу хімічних і фізичних чинників на геном живих організмів і дослідження молекулярно-генетичної природи індукованих мутацій. Хімічні мутагени є оптимальними для одержання точкових мутацій (чи малих внутрішньогенних делецій), для пошуку серій алельних чи умовних (наприклад, температурочутливих) мутацій або мутацій із заданим фенотипом (наприклад, поведінкових) [Greenspan, 1997]. Відомий мутаген - етилметансульфонат (ЕМС), який, будучи алкілюючим агентом, продукує велику кількість точкових мутацій [Ауэрбах, 1978; Ashburner, 1989]. Деякі автори [Lee et al., 1990] досліджували здатність ЕМС спричиняти мутації у генах дрозофіли, які контролюють морфологічні ознаки і біологічні процеси.

Наша мета - дослідити й ідентифікувати спектр мутацій, які виникають у геномі Drosophila melanogaster у процесі дії хімічного мутагену ЕМС.

Застосовували лінію дикого типу Oregon R з ізогенізованими хромосомами, отриману з музею ліній дрозофіли Університету м.Базеля (Швейцарія). Тестерними лініями були самки лінії зі зчепленими Х‑хромосомами (ХХ/Y) та самки Double Balancers (DB) за другою та третьою хромосомами, що давало змогу промтежували всі індуковані мутації: рецесивні і домінантні. Затравляли самців Oregon R триденного віку личинок згодовували 0,5 мМ розчином ЕМС у 1% розчині сахарози. Така концентрація спричиняла появу одної мутації в певному локусі на 1000 проаналізованих хромосом [Ashburner, 1989]. Затравлених самців і самців, які вилупилися з личинок, підданих дії EMС, схрещували з віргінними самками ХХ/Y (рис.1).

XX, y f *

P₁ : ♀ ═════ x ♂ ═══

Y Y

XX, y f XX, y f * Y

F : ♀ ♀ ═════ , ════ ; ♂♂ ═══ , ═══

Y * Y Y

А. Б. В. Г.

Рис. 1 . Схема виведення ізогенних за першою хромосомою ліній, де

А - самки D(X), yf, Б – суперсамки (нежиттєздатні);

В – самці Oregon R, Г- суперсамці (нежиттєздатні).

* Досліджувана хромосома.

Для ізоляції мутацій за аутосомами самців схрещували з віргінними самками DB.

. cn pr l(3),e * *

P₁ : ♀ ═══ ═══ x ♂ ══ ══

. Cy O~ TM6 * *

. cn pr l(3),e * *

P₂ : ♀ ═══ ═══ x ♂ ══ ══

. Cy O~ TM6 Cy O~ TM6

* * * *

P₃ : ♀ ═══ ═══ x ♂ ══ ══

. Cy O~ TM6 Cy O~ TM6

* * * *

P₄ : ♀ ═══ ═══ x ♂ ══ ══

* * * *

Рис. 2. Схема виведення ліній, ізогенних за другою і третьою хромосомами.

Досліджували одержані ізогенізовані культури. Виконували низку дослідів: затравляли триденних самців лінії Oregon R і двічі личинок згодовували мутагеном. Результати наведені в табл.1.

Унаслідок дії досліджуваного мутагену на самців лінії Oregon R серед 71 ізогенної культури 6 виявились стерильними. Крім того, отримали одного мутанта з білими очима й обрізаними крилами w^4-2ct^4-2 та одного мутанта зі зміненою формою очей R^4-2. У процесі личинкового згодовування мутагену одержали 741 ізогенну культуру, серед яких - одного мутанта зі зміненим кольором тіла y^17-2, чотири мутанти з редукованими фасетками очей і 45 стерильних ліній. Унаслідок повторного личинкового згодовування мутагеном морфологічних мутантів не виявили, однак простежили збільшення частоти виникнення стерильних самців.

Таблиця 1

Кількість і частота появи мутантів, індукованих ЕМС у лінії дикого типу Drosophila melanogaster Oregon R

Тип досліду*	Кількість проан. хромосом	Кількість стерильних мух	Кількість і тип отриманих мутантів	Частота появи мутантів
♂ L L	71 407 334	6 steril 23 steril 22 steril	1 w^4-2ct^4-2 1 R^4-2 1 y^17-2 1 R^5-2 1 R^44 1 R^152 1 R^197 —	4,25 10^-2 1,23 10^-2 —

* ♂ - затравка триденних самців, L – личинкове згодовування мутагеном.

Одержані мутанти ідентифікували. За допомогою комплементаційного тесту виявили, що мутації w^4-2, ct^4-2 і y^17-2 відповідають музейним мутаціям white, cut i yellow [Lindsley, Zimm, 1993]. Усі R-мутанти з редукованими фасетками були поділені на дві групи. Мутанти першої групи R^5-2 і R¹⁹⁷ характеризувались значною редукцією фасеток (круглі значно зменшені очі). У мутантів другої групи R ^4-2, R⁴⁴ і R¹⁵² були редуковані латеральні фасетки (смужкоподібні зменшені очі). Щоб дослідити належність мутантних генів до певної хромосоми, застосовували маркерні лінії ХХ/Y, st e та b cn. Результати схрещувань виявили, що R-мутації не містяться в статевій хромосомі. Для локалізації гена в другій хромосомі використали лінію b cn, а у третій – st e. Виявили, що мутанти R^5-2 і R¹⁹⁷ належать до другої групи комплементації, а мутанти R^4-2, R⁴⁴ і R¹⁵² - до третьої. Оскільки мутанти R^5-2 і R¹⁹⁷належать до одної хромосоми, між ними провели тест на комплементарність, який виявився негативним. Отже, ці мутації є алелями одного гена. Внаслідок аналізуючого схрещування з b cn виявили всі класи рекомбінантів. Обчислені проценти рекомбінації між генами (b–cn – 10%, cn-R¹⁹⁷ – 14,7% і b-R¹⁹⁷- 23%) дали змогу локалізувати мутацію R¹⁹⁷ (відповідно R^5-2) у локусі 72,0 другої хромосоми. Цей локус відповідає генові Lobe [Lindsley, Zimm, 1992]. Комплементарним тестом з музейною лінією Cy/Lobe підтвердили алельність генів R¹⁹⁷ і Lobe.

Унаслідок схрещування з маркерною лінією st e (ІІІ хромосома) аналогічно локалізували мутанти R⁴⁴ і R¹⁵² у локусі Drop (99,2) [Lindsley, Zimm, 1992] і підтверджено комплементаційним тестом з музейною лінією Dr/Xa. Серед досліджених мутантів лише мутант R^4-2 не виявив алельності з генами Drop і Lobe. Виконуються його подальші дослідження.

Отже, ЕМС з частотою 1,23 10^-2 - 4,25 10^-2 спричиняє морфологічні видимі мутації у першій, другій та третій хромосомах. У першій статевій хромосомі мутації виникали у локусах yellow, white і cut, а в другій і третій аутосомах були пов`язані з видозміною форми ока і зачіпали гени Lobe і Drop відповідно.

Робота виконана при сприянні INTAS (грант 96-1493).

___________________

1. Ауэрбах Ш. Проблемы мутагенеза. М. 1978.

2. Ashburner M., Gelbart W. Drosophila Genetic maps. Drosophila Information Servise. 1991.

3. Ashburner M. Drosophila. NY, USA. 1989. Vol.1.

4. Greenspan R.J. Fly pushing. The theory and practice of Drosophila genetics. NY, USA. 1997. P.23-46.

5. Lee W.R., Byrne B.J., Tucker A.B. Comparison of dose response relationships for ethyl methanesulphonate and 1-ethyl-1-nitrosourea in Drosophila melanogaster spermatozoa // Environ. and Mol. Mutagenes. 1990. Vol.17. P.33-34.

6. Lindsley D., Zimm G. The genome of Drosophila melanogaster. NY: Academic Press, Inc. 1992.