ВПЛИВ  КОФЕЇНУ НА ВИЯВ ГЕНЕТИЧНОЇ  НЕСТАБІЛЬНОСТІ                                                   У STREPOMYCES COELICOLOR  A3(2)

 

О. Мар'їна,  С. Заворотна, В.Федоренко                                          

 

Львівський національний університет імені Івана Франка

79005 Львів, вул.Грушевського,4

 

         Одним з найважливіших завдань генетики актиноміцетів є вивчення механізмів нестабільності їхнього геному.  Висока спонтанна мінливість ознак актиноміцетів відома  давно.  Однак детально вивчати  її механізми  почали  лише наприкінці 70-х років після відкриття явища генетичної нестабільності природної резистентності  актиноміцетів до антибіотиків [1, 6].  Дослідження різних представників роду Streptomyces виявили високий ступінь нестабільності їхнього геному,  що зумовлене рекомбінаційними подіями, які відбуваються з високою частотою. Наявні дані свідчать про різноманітність генетичних механізмів нестабільності  ознак  і  певний зв'язок  між нестабільністю генів та їхньою локалізацією в геномі актиноміцетів [2, 4, 8].  Генетично нестабільними є зокрема, такі важливі ознаки актиноміцетів,  за якими проводиться селекція (антибіотична активність, стійкість до антибіотиків, морфологічні ознаки). Це  заважає  ефективному  застосуванню багатьох штамів актиноміцетів для одержання антибіотиків у промисловості.  Слід,  однак,  зазначити, що конкретний характер  генетичних подій, які зумовлюють нестабільність у актиноміцетів, у багатьох випадках не вивчений. Дуже мало даних про зв’язок між генетичною нестабільністю та репаративними  процесами, а також про чинники, що зменшують рівень нестабільності ознак актиноміцетів. Таким чинником   може бути дія речовин, що інгібують певні системи репарації, які вливають на вияв генетичної нестабільності [3]. Одним з найбільш вивчених з погляду генетичної нестабільності є детермінант стійкості до хлорамфеніколу (сmlR) модельних об'єктів генетики  актиноміцетів   S.coelicolor A3(2) та  S.lividans 66.  Хлорамфенікол-резистентність  у цих штамів спонтанно втрачається з високою частотою (до 1 %)  [1, 5].

      Метою нашої роботи було вивчення  впливу кофеїну, відомого як інгібітор репарації,  на нестабільність ознаки хлорамфенікол-резистентності  (CMR)  у  S.coelicolor A3(2).  В експериментах  застосовували  штам   S18  S.coelicolor  A3(2) adeC (v10) cysD18 strA1 (аденін - та цистеїн - залежний, стійкий до стрептоміцину), природно резистентний  до  хлорамфеніколу  (стійкий до 20 мг/мл цього антибіотика в середовищі МС ),  і  його мутант S463,  який  є  чутливим  до  цього  антибіотика. Штами S.coelicolor A3(2)  отримали із колекції ДНДІ генетики (Москва).  Для підвищення рівня генетичної нестабільності  ознаки хлорамфенікол-резистентності спори S.coelicolor A3(2) опромінювали ультрафіолетом (УФ) за стандартною методикою [7]. Джерелом опромінення була бактерицидна лампа  BLM12.

 

 

 

 

   

 

 

Рис.1. Вплив ультрафіолетового опромінення на виживання спор штамів S.coelicolor А3(2) S18 та S463: 1 - S463 (ПТА), 2 - S18 (ПТА), 3 - S18(R2), 4 - S463(R2).

 

 

Вивчено залежність  виживання спор штамів S18 та S463 від дози УФ-опромінення.

Виявлено, що спори штаму S463 є чутливішими  до  УФ: у всіх використаних дозах частка життєздатних спор штаму S18 була в 1,9 - 2,6 раза більшою,  ніж штаму S463 (рис.1).   На життєздатність спор після опромінення ультрафіолетом  високими дозами, які спричиняють зменшення рівня виживання до  0,1-1%,  впливає склад поживного середовища: на пептон-триптозному агарі (ПТА: триптозний агар ( Ferak Berlin), 0,4% пептон, 1% глюкоза) рівень виживання спор після опромінення був дещо вищим,  аніж  на середовищі  R2 [7]. Для подальшої роботи використовували середовище ПТА і дози опромінення,  при яких  виживало близько 1% спор штамів S18 та S463.

     Вивчено вплив  кофеїну  на виживання спор штамів S18 та S463  (рис.2)  і підібрано субінгібувальну концентрацію  кофеїну,  яка для штаму  S18  становить   2 мг/мл  на середовищі ПТА (94%  виживання).  Зазначимо,  що чутливість штаму  до  кофеїну також залежить від складу середовища. На приклад, на середовищі R2 з концентрацією кофеїну 2 мг/мл виживає лише 39% спор штаму S18.

     Досліджували виживання спор штаму S18 після опромінення ультрафіолетом (час опромінення - 45 с, доза; яка спричиняла зменшення рівня  виживання - до 1%) та висівання на середовище  ПТА  з  субінгібувальною концентрацією кофеїну.  Виявили, що в таких умовах виживає 0,24%  спор штаму S18,  тобто  значно  менше,  ніж без кофеїну. Зменшення відсотка виживання спор після УФ-опромінення  за наявності інгібітора  репарації  кофеїну  свідчить про функціонування системи (систем) репарації УФ-пошкоджень під час проростання спор S.coelicolor A3(2) і здатність кофеїну інгібувати її.

На підставі аналізу частоти утворення CMS-мутантів штаму S18 після опромінення УФ  з  наступнимим  висівом  на середовище ПТА виявили,  що порівняно  з  контролем (неопромінені спори S18 на  середовищі без кофеїну),  частка CMS-мутантів  S18 після опромінення УФ зростає від 0,3%  до 37%. Висівання опроміненої  культури  на  середовище ПТА  з  кофеїном зменшує частоту виникнення CMS-мутантів до 12%.  52% CMS-мутантів, відібраних на середовищі без кофеїну, були нестабільними і в наступних генераціях розщеплювались на CMR- та CMS-клони. Серед  CMS-клонів, відібраних на середовищі з кофеїном,  було значно менше (15%) таких, які здатні до розщеплення.

 

 

 

 

 

Рис.2. Вплив кофеїну на виживання спор штамів S.coelicolor А3(2) S18 та S463: 1 - S18 (ПТА), 2 - S463 (ПТА), 3 - S18(R2), 4 - S463(R2).

 

     Вплив кофеїну на частоту виникнення CMR-ревертантів ми вивчали із застосуванням CMS-мутанта S463 штаму S18. Цей штам є дещо стійкішим,  аніж вихідний, до дії УФ  (1,9% виживання - час опромінення 45 с),  однак  чутливішим  до  кофеїну   (на середовищі ПТА з 2 мг/мл кофеїну  виживає 32%  спор). Частота утворення CMR-ревертантів у неопроміненої культури S463 - 0,06%, а в опроміненої - 0,3%. Унаслідок висівання неопромінених та опромінених спорів штаму S463 на середовище з кофеїном ревертантів отримати не вдалося.

      Отже, ультрафіолет здатний індукувати нестабільність генетичного детермінанта хлорамфенікол-резистентності  S.coelicolor A3(2). Цей факт, а також інгібування кофеїном  появи  CMS-мутантів, свідчить про те, що системи репарації УФ-пошкоджень можуть бути складовою частиною механізмів генетичної нестабільності актиноміцетів. Про це також свідчать результати, отримані іншими авторами, зокрема, в експериментах з інгібуванням репарації у S.cattleya, що призводило до зниження рівня нестабільності ознак цієї культури [3] і стимулювання генетичної нестабільності у S.ambofaciens антибіотиками, які діють на ДНК-гіразу [9].

      Одержані нами дані важливі для визначення підходів до стабілізації ознак актиноміцетів і отримання стабільних промислових штамів. Такими підходами могли б бути застосування специфічних інгібіторів тих репаративних процесів, які зумовлюють цю нестабільність, або отримання мутацій, які ці процеси порушують.

                                                         

 

___________________

 

1.   Федоренко В.А., Даниленко В.Н. Нестабильность природной множественной лекарственной устойчивости у актиномицетов // Антибиотики.1980.№ 3. С.170-174.

2.   Chen C., Lin Y.-S., Yang E.L et al. Structure and dinamics of the linear chromosomes of streptomycetes //  Theses the 9th Int.  Symp.  of the Biology of Actinomycetes, Moscow, 1994. P.  152.

3.   Coyne V.E.,  Usdin K.,  Kirby R. Mutagenesis by N - methyl- N’ - nitro- N - nitrosoguanidine in Streptomyces coelocolor  // J. Gen. Microbiol. 1984. Vol.130. P.887-892.

4.   Cullum J., Redenbach M. Arnold A., et al. Genetic instability in Streptomyces lividans 66 // Proc. of the 9th Int.  Symp.  of the Biology of Acti-nomycetes, Moscow, 1994. P. 95 - 98.

5.   Freeman   K.F.,   Bibb   M.J.,   Hopwood   D.A. Chloramphenicol acetyltransferase - independent  chloramphenicol  resistance in Streptomyces coelicolor A3(2)// J.  Gen. Microbiol. 1977. Vol.98. P.  453-463.

6.   Freeman R.F., Hopwood D.A. Unstable naturally occurring resistance for antibiotics in Streptomyces // J. Gen. Microbiol.1978. Vol.106. P.377-381.

7.   Hopwood D.A., Bibb M.J., Chater K.F et al. Genetic manipulation of Streptomyces:// A laboratory manual. 1985. The John Innes Foundation.

8.   Leblond P.,  Decaris B.  Genetic instability in Streptomyces ambofaciens genome structure, inducibility of the rearrangements and expression of the unstable region //  Theses of the 9th Int. Symp. of the Biology of Actinomycetes. Moscow, 1994. P.42.

9.   Volff J.-N., Vandewiele D.,  Simonet J.-M., Decaris B. Stimulation of genetic instability in Streptomyces ambofaciens ATCC23877 by antibiotics that interact with DNA gyrase // J.Gen.Microbiol.1993.Vol.139.P.2551-2558.