К. Панькевич, О. Мар’їна, С. Заворотна, В. Федоренко

Львівський національний університет імені Івана Франка

вул.Грушевського, 4, м.Львів, 79005 Україна

Інтерес до вивчення генетики актиноміцетів зумовлений тим, що ці організми продукують широкий спектр вторинних метаболітів з антибіотичними, гербіцидними, антигельмінтними, протипухлинними та імуносупресорними властивостями [1, 6]. З'ясування механізмів, що є в основі генетичного контролю утворення цих речовин, дає змогу цілеспрямовано підходити до отримання їхніх надпродуцентів. У цьому разі традиційні методи мутагенезу і селекції повинні доповнюватися сучасними генно-інженерними підходами, які дають ширші можливості для конструювання штамів-продуцентів певних сполук. Найважливішим антибіотиком, що успішно застосовується для лікування інфекційних захворювань, є еритроміцин, продуцентом якого є актиноміцет Saccharopolyspora erythraea. Досягнуто значного успіху у вивченні основних етапів утворення цього макролідного антибіотика. Ідентифіковано і майже повністю секвеновано кластер генів, які контролюють біосинтез еритроміцину [3, 4].

Наша мета - вивчити можливості генно-інженерного конструювання штамів-продуцентів еритроміцину S.erythraea шляхом уведення в геном додаткових копій пізніх генів біосинтезу еритроміцину, які можуть контролювати лімітуючі етапи утворення антибіотика.

Ми застосовували фрагмент кластера генів біосинтезу еритроміцину (ery) S.erythraea довжиною 5,5 тпн, що містив гени пізніх етапів біосинтезу еритроміцину - eryD і eryCI (рис.1). Вважають, що ген eryCI бере участь у біосинтезі або приєднанні до агліконової частини еритроміцину дезоксицукру дезозаміну [2, 7], а ген eryD, можливо, є позитивним регулятором біосинтезу дезозаміну та іншого цукру, що є у складі еритроміцину, - мікарози [9].

Ми виконували субклонування EcoRI-HindIII-фрагмента (5,5 тпн) ery-кластера в полілінкер човникового вектора pWHM4 (див. рис.1). Відомо, що плазміда pWHM4 здатна реплікуватись у клітинах E.coli завдяки ori реплікації плазміди ColEI, а в клітинах актиноміцетів - ori реплікації плазміди pWOR109. Вона має також два маркерних гени: ампіцилін-резистентності (для селекції клонів E.coli, що несуть цю плазміду) та тіостриптон-резистентності (для селекції pWOR109⁺-клітин актиноміцетів). Отриману гібридну плазміду, позначену як pWHM4 E/H, розміром 12,1 тпн, що містила гени eryD i eryCI, застосовували для трансформації протопластів штамів S.erythraea К1 та Л5, які селекціонували на підвищену антибіотичну активність, і штаму S.erythraea 5002, що спричиняє мутацію в гені eryD і незданий синтезувати еритроміцин.


Рис.1. Схема конструювання рекомбінантної плазміди pWHM4E/H, яка несе гени eryD i eryCI. Сайти розщеплення рестриктазами: E - EcoRI, S - SacI, K - KpnI, M - SmaI, B - BamHI, X - XbaI, L - SalI, T - PstI, P - SphI, H - HindIII, V – PvuII; E.coli ori - ori-реплікації у клітинах E.coli, Str.ori - ori-реплікації в клітинах актиноміцетів, amp - маркер ампіцилін-резистентності, tsr - маркер тіострептон-резистентності, gal - ген b-галактозидази


Рис.2. Антибіотична активність трансформантів штамів S.erythraea К1 (а) і Л5 (б), які несуть рекомбінантну плазміду pWHM4E/H.

Отримували протопласти штамів S.erythraea K1, L5 та 5002, їх трансформували та регенерували, а також селекціонували трансформанти згідно зі стандартними методиками [5]. Антибіотичну активність вихідних штамів і трансформантів аналізували мікробіологічним методом на тест-культурі Bacillus mycoides HB₂, визначаючи їх індекси продуктивності (ІП) - відношення діаметра зони пригнічення росту тест-культури до діаметра колонії.

Частота pWHM4 E/H⁺ трансформантів штаму S.erythraea K1 становила близько 0,2´10² клітин на мкг ДНК. Було відібрано два стабільних клони тіострептон-резистентних трансформантів (Т1 і Т2). Аналізуючи їхню антибіотичну активність, виявили, що штами Т1 і Т2 перевищували за цією ознакою вихідний штам К1 у середньому в 3,0 і 1,7 раза відповідно (рис.2,а). У випадку штаму S.erythraea L5 частота трансформантів становила близько 0,3´10² клітин на мкг ДНК. Було відібрано три стабільних клони тіострептон-резистентних трансформантів: Т3, Т4 і Т5. За антибіотичною активністю штам Т5 не відрізнявся від вихідного штаму L5, тоді як штами Т3 і Т4 перевищували вихідний штам за рівнем антибіотичної активності у 1,3 і 1,2 раза відповідно (рис.2,б).

Виконуючи експерименти з трансформації гібридною плазмідою pWHM4 E/H штаму S.erythraea 5002 (частота трансформації - 0,4´10² клітин на мікрограм ДНК), отримали чотири стабільних трансформанти, у яких простежувалося часткове (штами 5002.3, 5002.4 і 5002.10) та повне (штам 5002.16) відновлення біосинтезу еритроміцину.

Щоб проаналізувати, що відбулось в геномі S.erythraea внаслідок трансформації рекомбінантною плазмідою pWHM4 E/H, виконували ДНК-ДНК гібриди-зацію. Сумарну ДНК, виділену із штамів-трансформантів та з реципієнтних штамів, розщеплювали ендонуклеазою рестрикції BglII, розділяли в 1% агарозному гелі, пе-реносили на нейлоновий фільтр "Hybond" і гібридизували з міченим дигоксигеніном BamHI-фрагментом ery-кластера, довжиною 3,5 тпн, що містив гени eryD i eryCI. Мічення ДНК, ДНК-ДНК гібридизацію, відмивання та проявлення фільтрів виконували згідно з методикою, запропонованою фірмою-виробником набору для гібридизації з використанням дигоксигенінової мітки (DIG-hybridization kit) [8]. Розташування смуг гібридизації (рис.3), а також те, що плазмідну ДНК з клітин трансформантів виділити не вдалося, свідчить про інтеграцію плазміди pWHM4 E/H у хромосому реципієнта, а інтенсивність гібридизаційних сигналів - що інтеграція плазміди в хромосому спричиняє ампліфікацію клонованої послідовності ДНК. Це узгоджується з літературними даними про здатність вектора pWHM4 спричиняти геномні перебудови [9]. Для штамів-трансформантів S.erythraea Т1, Т2, Т3, Т4 і Т5 простежувалася помітна кореляція між інтенсивністю гібридизаційного сигналу і рівнем антибіотичної активності. Найінтенсивнішу смугу спостерігали, досліджуючи ДНК штаму Т2, який мав найвищу антибіотичну активність. У порядку зменшення інтенсивності сигналу розташовували зразки ДНК штамів Т1, Т3 і Т4, в яких рівень антибіотичної активності був більший від вихідного в 1,7, 1,3 і 1,2 раза відповідно. У випадку штаму Т5, який не відрізнявся від вихідного за рівнем антибіотичної активності, простежували найменш інтенсивний сигнал гібридизації. Кореляції між інтенсивністю гібридизаційного сигналу та ступенем відновлення антибіотичної активності у штамів-трансформантів 5002.4, 5002.10 і 5002.16 не простежували. Вірогідно, ступінь комплементації eryD мутації залежить від місця кросинговеру між гомологічними послідовностями пошкодженого гена eryD у хромосомі штаму 5002 і клонованого в плазміді pWHM4 eryD гена дикого типу, а не від ступеня ампліфікації цього сегмента хромосоми. У випадку штамів Т1, 5002.16, і 5002.10 поряд із смугою гібридизації, що відповідає BglII-фрагменту хромосоми розміром 17 тпн, де знаходяться гени eryD i eryCI і, очевидно, відбувається інтеграція рекомбінантної плазміди pWHM4 E/H, простежували додаткову смугу гібридизації з фрагментом розміром близько 12 тпн, який міг би відповідати автономній плазміді. Щоб перевірити це припущення, зі всіх штамів-трансформантів і вихідних зробили спробу виділити плазмідну ДНК, яка не виявилась успішною. Можливо, поява додаткової смуги гібридизації є наслідком хромосомних перебудов, які здатна викликати плазміда pWHM4 E/H після інтеграції.

Рис.3. Результати ДНК-ДНК гібридизації сумарної ДНК штамів S.erythraea, розщепленої ендонуклеазою рестрикції BglII, i DIG-міченого фрагмента плазміди pWHM4E/H з генами eryD i eryCI:

1 - S.erythraea 5002, 2 - 5002.4, 3 - 5002.10, 4 - 5002.16, 5 - 2407, 6 - 2407.3, 7 - 2407.4, 8 - Л5, 9 - Т4, 10 - Т5, 11 - Т3, 12 - К1, 13 - Т1, 14 - Т2, 15 - S.coelicolor S18

Отже, шляхом введення в геном S.erythraea додаткових копій фрагмента ДНК, що містить гени біосинтезу еритроміцину eryD та eryCI у складі рекомбінантної ДНК, нам вдалося отримати трансформанти з підвищеною антибіотичною активністю. Одержані результати свідчать про перспективність генно-інженерного конструювання як одного з етапів селекції продуцента еритроміцину S.erythraea.

___________________

1.Chater K.F., Hopwood D.A. Streptomyces // In B.subtilis and other gram-positive bacteria / Ed. A.L. Sonenshien. Washington, 1993. P.251-271.

2.Dhillon N., Hale R.S., Cortes J., et al. Molecular characterisation of a gene from Saccharopolyspora erythraea (Streptomyces erythreus) which is involved in erythromycin biosynthesis // Mol. Microbiol. 1989. Vol.3. P.1405-1414.

3.Donadio S., Katz L. Organization of the enzymatic domains in the multifunctional polyketide synthase involved in erythromycin formation in Saccharopolyspora erythraea // Gene. 1992. Vol.111. P.51-60.

4.Haydock S.F., Dowson J.A., Dhillon N., et al. Cloning and sequence analysis of genes involved in erythromycin biosynthesis in Saccharopolyspora erythraea: sequence similarities between EryG and a family of S-adenosylmethionin-dependent methiltransferase // Mol. Gen. Genet. 1991. Vol.230. P.120-128.

5.Hopwood D.A., Bibb H.J., Chater K.F., et al. Genetic manipulation of Streptomyces: A laboratory manual. The John Innes Fundation. Norwich, 1985.

6.Omura S. Introduction. // In The Bacteria. Ed. W. Queener, E. Day. New York, 1985. P.7-12.

7.Staunton J., Wilkinson B. Biosynthesis of erythromycin and rapamycin // Chem.Rev. 1997. Vol.97. P.2611-2629.

8.The DIG system user’s guide for filter hybridization. Boehringer Mannheim Biochemica. Mannheim, 1996.

9. Vara J., Levandovska-Skarabek M., Wang Y. G. et al. Cloning of genes governing the deoxysugar portion of the erythromycin biosynthesis pathway in Saccharopolyspora erythraea. // J. Bacteriol. 1989. Vol.171. P. 5872-5881.