ВПЛИВ ФІЗИКО-ХІМІЧНИХ ФАКТОРІВ НА АКТИВНІСТЬ ФЕРМЕНТНИХ ПРЕПАРАТІВ ДРІЖДЖІВ PHAFFIA PHODOZYMA

О.Подопригора, М.Коструба, С.Гнатуш, І.Клим, Б.Борсукевич

Львівський національний університет імені Івана Франка

вул.Грушевського, 4, м.Львів, 79005 Україна

e-mail: biolog@ franco. Lviv.ua

Вивчено вплив температури інкубації, аерації, концентрації d-амінолевулінової кислоти (d-АЛК), рН та якісного складу буферних розчинів на активність ферментних препаратів, одержаних у результаті обробки клітин дріжджів P.rhodozyma, охолодженим до 15^о С ацетоном. Препарати здатні перетворювати попередник тетрапірольної структури - d-амінолевулінову кислоту - в порфірини, про що свідчить поява червоного забарвлення інкубаційної суміші ферментних препаратів у буферному розчині та яскраво червона флюорисценція в ультрафіолетовому світлі.

Спектр поглинання речовин, що відповідає за флюорисценцію і забарвлення в видимій частині світла, має максимум у межах 401-405 нм, а також чотири піки поглинання в межах 480-620 нм, що свідчить про нагромадження порфіринів в інкубаційній суміші.

Промислове виробнцтво порфіринів і гемовмісних ферментів постійно збільшується. Досліджуються можливості використання нових природних джерел пігментів, освоєння синтетичних методів одержання порфіринів і їхніх похідних.

Порфірини перестають бути сполуками, які використовують виключно як біохімічні реактиви. Їх щораз більше застосовують в хімії, харчовій промисловості та в медицині [7,8].

Поряд з природними і хімічними способами одержання порфіринів та їхніх похідних, найбільш перспективним є мікробіологічний. Наприклад, хлорофіл-а виділяють з представників роду Chlorella, бактеріохлорофіл-а - з Chromatium, цитохром-с - з Saccharomyces cerevisiae, а цитохром-в - з Lactobacillus leichmanii [4].

Розроблені методи одержання копропорфірину ІІІ із застосуванням суспензії клітин Propionibacterium shermanii, які попередньо витримувались на мінімальних середовищах. Нагромадження порфіринів у процесі інкубації таких суспензій на середовиші з глюкозою (20 г/л), мінеральними солями і d-АЛК (50мг/л) в анаеробних умовах при 30^оС протягом 48 год становить 17 мг/л. Вихід очищеного кінцевого продукту досягає 90% від його вмісту в фільтраті середовища [7, 5].

Здатність клітин мікроорганізмів, висушених охолодженим ацетоном, до трансформації d-АЛК у тетрапіроли описана в літературі [6]. У таких препаратах зберігає активність фермент АЛК-дегідратаза, який каталізує процес конденсації двох молекул d-АЛК з утворенням монопіролу порфобіліногену (ПБГ). Полімеризація чотирьох молекул ПБГ унаслідок дії ферменту порфобіліногендезамінази приводить -

до утворення лінійного білану. Наступний фермент уропорфіриноген ІІІ-косинтетаза перетворює лінійний білан у природний ізомер уропорфірин ІІІ [4].

Роботу виконували з культурою дріжджів P. rhodozyma, яку вирощували і підтримували у середовищі такого складу (г/л): сахароза - 20,0; пептон - 1,0; (NH₄)₂SO_{4 -} 2,0; КН₂РО₄ - 1,0; MgSO₄ - 7H₂O - 0,5; СаСІ₂ - 0,1; вода - до 1 л.

Культивування дріжджів виконували в колбах Ерленмейєра об’ємом 500 мл, об’єм поживного середовища - 100 мл. Посівний матеріал ( однодобовий інокулят) вносили з розрахунку 300 мкг/мл.

Дріжджі вирощували в аеробних умовах на круговій качалці ( 200 об / хв) протягом 48 год при температурі 22^оС. Корекцію рН до 6,0-7,0 виконували в добовій культурі насиченим розчином бікарбонату натрію.

Біомасу дріжджів визначали ваговим методом у бюксах, після висушування відмитих клітин до постійної маси при температурі 105^оС.

Для одержання ферментних препаратів використовували дводобову культуру P.rhodozyma. Відцентрифуговані клітини промивали 0,05М калій-фосфатним буфером (рН-7,2). Біомасу ресуспензували в невеликому об’ємі того ж буферу й обробляли десятикратною кількістю охолодженого до 10^оС ацетону [9].

Інкубацію ферментних препаратів виконували в колбах об’ємом 500 мл, вміст інкубаційної суміші - 400 мл, концентрація d-АЛК - 50 мг/л, ферментних препаратів - 1мг/мл на суху масу.

Білки ферментних препаратів осаджували 20% розчином трихлороцтової кислоти, 10 хв витримували на холоді і відділяли центрифугуванням. Супернатант розводили в 10-20 разів 1н НСІ. Оптичну густину розчину визначали на спектрофотометрі СФ-26.

Кількість порфіринів обчислювали за формулою:

С_мкг/мл = 0,817 х 2Д₄₀₅ - (Д₃₈₀ + Д₄₃₀),

де Д₄₀₅ - оптична густина розчину при 405 нм; Д₃₈₀ - оптична густина розчину при 380 нм; Д₄₃₀ - оптична густина розчину при 430 нм.

Для визначення якісного та ізомерного складів профіринів розчини випарювали під вакуумом при 25^оС до сухого залишку і розділяли методом тонкошарової хроматографії.

Метилювання вільних кислот порфіринів виконували в розчині метанол - коцентрована сірчана кислота 95 : 5 (за об’ємом) у темноті протягом 24 год [2].

До суміші додавали 5 об’ємів дистильованої води і з цього розчину метилові ефіри порфіринів екстрагували хлороформом і сушили над безводним Na₂SO₄, фільтрували і випарювали під вакуумом. Хроматографію метилових ефірів порфіринів виконували в двох системах розчинників: метонол-ізопропанол-гексан (1:2:5) і бензол-етилацетат-етанол (85:13,5:1,5) [1].

Як мітчики для тонкошарової хроматографії порфіринів використовували суміші ізомерів уропорфіринів, одержаних шляхом неензиматичної конденсації ПБГ, утвореного ферментативно суспензією клітин P.shermanii із екзогенної d-АЛК.

Диметиловий ефір протопорфірину ІХ одержували з пігментів шкарлупи перепелиних яєць.

Ферментні препарати, одержані в результаті обробки клітин P.rhodozyma, охолодженим до 10^оС ацетоном, мають здатність перетворювати попередник тетрапірольної структури d- амінолевулінову кислоту - в порфірини.

Спектри поглинання речовин, що дають флюорисценцію і забарвлення у видимій частині світла, сягають максимуму у межах 401-405 нм та мають чотири піки поглинання в межах 480-620 нм. Результати спектрофотометрії свідчать про нагромадження порфіринів в інкубаційній суміші.

Головними фізичними факторами, які впливають на утворення порфіринів ферментними препаратами дріжджів P.rhodozyma, є температура, аерація та час інкубації.

Як виявили виконані дослідження, максимальний синтез порфіринів ферментними препаратами простежується при 30^оС (табл.1).

Таблиця 1

Вплив температури інкубації на синтез порфіринів

ферментними препаратами дріжджів P. rhodozyma

Температура інкубації,^оС	Вміст сухого ферментного препарату,мг/мл	Концентрація d-АЛК, мг/л	Вільні порфірини,мг/л
20 1 50 6,8^+0,8 30 1 50 10,9+0,7 37 1 50 8,4+0,9

Аерація (табл.2) негативно впливає на біосинтез порфіринів ферментними препаратами, спричиняючи його інгібування більше як на 30%.

Таблиця 2

Вплив аерації на синтез порфіринів ферментними препаратами

дріжджів P. rhodozyma

Умови інкубації	Вміст порфіринів,мг/л	Форма порфіринів
Без аерації 10,3+0,5 Уропорфірин Аерація 6,9+0,6 Уропорфірин

Однак навіть в умовах аерації ферменти порфіриногенезу зберігають деяку активність, що підтверджується літературними даними [1].

Досліджуючи динаміку утворення порфіринів ферментними препаратами, виявили, що максимальна їхня активність зберігається протягом 75 год інкубації. Більш тривала інкубація в буфері з d-АЛК приводить до зниження активності ферментних препаратів, а відповідно і рівня пігментоутворення. Причиною цього може бути часткова денатурація білків-ферментів.

Вивчаючи порфіриноутворення залежно від складу і рН буферної інкубаційної суміші, виявили, що максимальний вміст порфіринів простежується під час інкубації ферментних препаратів у натрій-фосфатному буфері рН 8,0 (табл.3).

Одержані результати узгоджуються з літературними даними про активність АЛК-дегідратази в нейтральних і лужних умовах [4].

Значний вплив на синтез порфіринів ферментними препаратами дріжджів P.rhodozyma має концентрація екзогенного попередника d-АЛК. Як видно з табл.4, збільшення концентьрації d-АЛК приводить до збільшення порфіриноутворення. Якщо збільшується концентрація попередника від 1 до 15 мг на 100 мл, продуктивність порфіриногенезу зростає майже в 10 разів. Це свідчить, що процес утворення порфіринів, у якому беруть участь ферменти АЛК-дегідратаза і ПБГ компллекс, підпорядкований закономірностям ферментативної кінетики.

Таблиця 3

Вплив рН та складу буферу на синтез порфіринів ферментними препаратами дріжджів P. rhodozyma

Буфер, рН	Вміст d-АЛК, мг/л	Вміст сухого ферментного препарату, мг/мл	Порфірини, мг/л
0,2М натрій- фосфатний 6,0 50 1 5,2+0,4 7,0 50 1 8,7+0,7 8,0 50 1 10,4+0,2 0,2М калій- натрій-фосфатний 6,0 50 1 3,4+0,4 7,0 50 1 7,3+0,6 8,0 50 1 6,2+0,3 0,2МТрис-НСІ 6,0 50 1 3,3+0.5 7,0 50 1 6,7+0,3 8,0 50 1 7,4=0,9

Відомо,що біосинтез тетрапірольних сполук мікроорганізмами залежить від наявності іонів таких металів, як Fe²⁺,Co²⁺, Mo⁶⁺, Ni²⁺ . Залізо стимулює синтез порфіринів у всіх аеробних мікроорганізмів, зокрема в дріжджів, одноклітинних водоростей та аеробних бактерій [3]. У бактерій кобальт є необхідним чинником для координації гілки біосинтезу функціональних тетрапіролів, що мають спільний попередник.

Таблиця 4

Вплив концентрації d-АЛК на синтез порфіринів ферментними препаратами дріжджів P. rhodozyma

Вміст d-АЛК, мг/л	Вміст ферментних препаратів, мг/мл	Вміст порфіринів, мг/л
0 1 0 10 1 2,1 25 1 5,1 50 1 10,3 75 1 14,2 100 1 17,3 150 1 20,2

Вивчали вплив деяких металів на трансформацію d-АЛК у порфірини в безклітинному екстракті дріжджів P. rhodozyma. Результати дослідів, наведені в табл.5, свідчать, що максимальний стимулюючий ефект на утворення порфіринів ферментними препаратами дріжджів P. rhodozyma виявляє залізо.

Таблиця 5

Вплив іонів металів на утворення порфіринів ферментними

препаратами дріжджів P. rhodozyma

Вміст порфіринів (мг/л) при наявності іонів						Контроль
Fe^2+	Cu^2+	Hg^2+	Mo^6+	Ni^2+	Co^2+
15,6 0 4,2 6,4 0 0 10,9

Як видно з табл.5, інгібуючий ефект на синтез порфіринів виявляють іони міді, нікелю та кобальту. Це явище пояснюється тим, що ферменти, які діють на початкових етапах біогенезу тетрапірольних сполук, є сірковмісними білками, активність яких підвищується при наявності іонів заліза, калію та натрію.

На підставі досліджень якісного складу порфіринів, синтезованих ферментними препаратами дріжджів P. rhodozyma, виявили, що головним і єдиним компонентом є уропорфірин.

Отже, у процесі одержання ферментних препаратів і їхньої інкубації відбувається розщеплення порфобіліногеназного комплексу, а саме лабільнішого його компонента ‑ косинтетази, наслідком чого є утворення уропорфірину.

Високий рівень нагромадження порфіринів, стабільність ферментних препаратів і відносна простота процесу інкубації свідчать про перспективність цього методу одержання порфіринів для біотехнологічних цілей.

___________________

1. Аскаров К.А., Березин Б.Д., Евстигнеева Р.П. Порфирины: структура, свойства, синтез.- М.,1985.

2. Быховский В.Я., Зайцева Н.И., Яворская А.Н. Регуляция биосинтеза тетрапир-рольных соединений у микроорганизмов // Биохимия синтеза и обмена коферментов и коферментных витиминов.-К., 1974. С.120-125.

3. Быховский В.Я., Зайцева Н.И. Влияние некоторых физико-химических факторов на биосинтез витамина В₁₂ и порфиринов покоящимися суспензиями Propionibacterium shermanii // ДАН СССР.1976. Вып.176. №6.С.1435-1440.

4. Быховский В.Я., Зайцева Н.И. Биосинтез корриноидов и других тетрапиррольных соединений ацетонным клостридием // Прикл. биохимия и микробиология. 1983.Т.20.№2.С.175-189.

5. Быховский В.Я., Зайцева Н.И. Микробиологический синтез тетрапиррольных соединений // Прикл. биохимия и микробиология. 1983. Т.4.№6. С.156-159.

6. Быховский В.Я., Зайцева Н.И., Полулях О.В. Микробиологический синтез порфиринов. М., 1985.

7. Быховский В.Я., Зайцева Н.И., Полулях О.В. Биосинтез порфиринов микроорга-низмами // Прикл. биохимия и микробиология. 1987.Т.24. №6. С.725-739.

8. Румянцева В.Д. Применение порфиринов: Тез.докл. ІY Всесоюз. конф. по химии и применению порфиринов ( Ереван, ноябрь 1984г.). Изд-во ЕГУ, 1984.С.58-75.

9. Vogelmann H. Chahremani B. Preparation of porphobilinogen and uroporphyrin III from ALA by pretneated cells of Chromatium vinosum. // Eur. J. Appl. Microbiol. 1975. Vol.2. P.19-28