ВПЛИВ СУМІЩЕННЯ МУТАЦІЙ RIB80 I HIT НА БІОСИНТЕЗ РИБОФЛАВІНУ ТА ФЕРИРЕДУКТАЗНУ АКТИВНІСТЬ У ДРІЖДЖІВ PICHIA GUILLIERMONDII
Т.Романюк*, Д.Федорович**, О.Протченко**, С.Гудзь*
*Львівський національний університет імені Івана Франка
вул.Грушевського, 4, 79005 Львів, Україна
**Відділення регуляторних систем клітини Інституту біохімії
ім.О.В.Палладіна НАН
України, вул.Драгоманова, 14, 79005 Львів, Україна
У дріжджів Pichia guilliermondii виявлено регуляцію біосинтезу рибофлавіну (РФ) за позитивним і негативним типом дії. Позитивний контроль флавіногенезу відбувається за участю генів RIB83, RIB84, негативний - іонів Fe(II) та продуктів генів RIB80, RIB81 і HIT [5]. Причому мутація rib83 епістатує над мутаціями rib80 і rib81. Зниження вмісту заліза в клітинах цих дріжджів і пошкодження регуляторних генів RIB80, RIB81 і HIT стимулюють синтез РФ, спричиняючи дерепресію більшості ферментів флавіногенезу. Крім здатності до надсинтезу РФ, клітини мутантів rib80, rib81 i hit мають високу швидкість поглинання заліза, підвищену фериредуктазну активність та вищий вміст цього металу в клітинах, що свідчить про участь генів RIB80, RIB81 i HIT у регуляції транспорту заліза, а отже, - їх поліфункціональність [3, 8, 9]. Суміщення в гаплоїдному геномі мутацій rib80 i rib81 призводить до підвищення рівня біосинтезу РФ, активностей ГТФ-циклогідролази і РФ-синтази, а також збільшення швидкості поглинання 55Fe клітинами, що означає, що продукти генів rib80 i rib81 взаємодіють за типом синергізму [7]. Як взаємодіють між собою інші гени, що контролюють флавіногенез і транспорт заліза у дріжджів, не вивчено.
Тому ми поставили за мету селекціонувати подвійні мутанти rib80hit дріжджів P.guilliermondii та дослідити деякі їхні властивості.
Використовували штами дріжджів P.guilliermondii генетичної лінії L2 і мутанти цього виду дріжджів rib80 1022-11, 1022-30, 1022-31, 1022-32, 1018-22 [10] та hit 1-5, 1-16 [3]. Застосовували методи вирощування дріжджів та їхньої гібридизації [4, 6]. Біомасу дріжджів визначали турбідиметрично на фотоелектроколориметрі ФЕК-56М (світлофільтр 6, кювета 3 мм), флавіни - флюориметрично на приладі ЭФ-3М. Активність ГТФ-циклогідролази і РФ-синтази визначали у безклітинних екстрактах [1, 2].
Фериредуктазну активність вимірювали за модифікованим методом Лезюіса [11]. Клітини з пізньої логарифмічної фази росту відмивали двічі дистильованою водою. Інкубаційна суміш містила 2% глюкози, 1% aa¢-дипіридилу, 0,05 М калій-фосфатний буфер рН 5,8 і 2 мг клітин. Загальний об’єм суміші – 5 мл. Клітини преінкубували на качалці протягом 20 хв. Потім додавали Fe(III)-цитрат (0,09 mМ) і інкубували ще 20 хв. Реакцію призупиняли, осаджуючи клітини 3 хв при 2000 об./хв. Вміст комплексу Fe(II) з aa’-дипіридилом визначали за допомогою спектрофотометра Spectromom-204 при λ=522 нм.
Для селекції штамів, які б містили в одному гаплоїдному геномі обидва пошкоджені гени (RIB80 і HIT), мутанти rib80 (1022-11, 1022-30, 1022-31, 1022-32, 1018-22) схрестили з мутантами hit 1-5 і hit 1-16. Отримали чотири гібриди, які мали низьку флавіногенну і фериредуктазну активність. Один з таких гібридів (HIT rib80 1022-31x hit1-5 RIB80) використали для виділення мейотичних сегрегантів. Із 154 відібраних ауксотрофних сегрегантів 110 мали підвищену флавіногенну активність. Крім цього, у всіх флавіногенних сегрегантів, як і вихідних штамів rib80 та hit, була високою редуктазна активність. Клітини виділених сегрегантів з високою швидкістю відновлювали трифенілтетразолій хлорид (ТТХ). Якщо сегреганти росли на середовищі з ТТХ (40 мг/л), то їхні колонії були червоними. Серед цих сегрегантів могли бути такі, які б містили обидві мутації - rib80 і hit.
Виявлено, що мутації rib80 і hit - моногенні та рецесивні [3, 9]. Тому для визначення наявності обох мутацій у відібраних сегрегантів застосовували гібридизацію кожного сегреганта з мутантами rib80 і hit. У 30 сегрегантів отримали гібриди з обома мутантами. Лише гібриди, одержані схрещуванням сегрегантів S18 і S19 з мутантами rib80 і hit (S18 x rib80 1022-31, S18 x hit 1-5, S19 x rib80 1022-31, S19 x hit 1-5), утворювали червоні колонії на агаризованому середовищі з ТТХ. У них перевіряли флавіногенну і фериредуктазну активності (табл.1). Вміст РФ у культуральній рідині гібридів перевищував рівень штаму дикого типу в 10-16 разів. Активність фериредуктази майже в 10 разів була вищою ніж у L2.
Таблиця 1
Ріст, флавіногенез та фериредуктазна активність штаму дикого типу та гібридів, отриманих схрещуванням сегрегантів S18, S19 з мутантами rib80, hit
Штами | Біомаса, | Рибофлавін | Активність фериредуктази, | |
| мг/мл | мг/л | мг/г сух.клітин | НмольFe/(мг клітин·хв) |
L2 S18 x rib80 1022-31 S18 x hit 1-5 S19 x rib80 1022-31 S19 x hit 1-5 | 7.0 5.7 6.2 8.0 7.0 | 1.89 19.20 30.30 26.76 30.25 | 0.27 3.37 4.89 3.35 4.32 | 2.13 18.60 23.74 20.32 22.40 |
Висока флавіногенна і фериредуктазна активність у гібридів обох типів означала, що сегреганти S18 і S19 містять дві мутації - rib80 i hit. Отож ми відібрали два сегреганти, які поєднували в одному гаплоїдному геномі обидві мутації.
У виділених мутантів визначали вміст РФ у культуральній рідині та клітинах (табл.2).
Таблиця 2
Ріст та флавіногенез штаму дикого типу, мутантів rib80, hit та сегрегантів S18, S19
Штами | Біомаса, мг/мл | Рибофлавін, ммоль/г сух.клітин | ||
| | середовища | клітин | S флавінів |
L2 rib80 1022-31 hit 1-5 rib80hit – S18 rib80hit – S19 | 2.9 0.7 1.6 2.1 1.8 | 0.32 3.46 3.68 8.46 13.75 | 0.03 0.21 0.27 0.53 0.90 | 0.35 3.67 3.95 8.99 14.65 |
Сегреганти S18 у 2,5 i S19 - в 4 рази мали вищу продуктивність флавіногенезу, порівнюючи з вихідними штамами rib80 1022-31 i hit 1-5. Клітини досліджуваних штамів містили невелику кількість РФ, у сегрегантів вона була більшою порівняно із батьківськими штамами (особливо у S19 - в 3,5 раза). Середня кількість РФ, виділеного у культуральну рідину, становила у rib80 - 8,95±1,2 і 3,56±0,87 мг/л у hit. Флавіногенна активність сегрегантів була значно вищою - 27,4 ±1,5 у S18 і 15,9±0,4 мг/л у S19.
Активність ферментів біосинтезу вітаміну В2 - ГТФ-циклогідролази та РФ-синтази - у штамів S18 і S19 перевищувала рівень батьківських штамів у 1,5 –2,0 рази (табл. 3).
Таблиця 3
Активність ГТФ-циклогідролази, РФ-синтази і фериредуктази штаму дикого типу, мутантів rib80, hit і сегрегантів S18, S19
Штами | ГТФ-циклогідролаза, Е/мг білка ·10-5 | РФ-синтаза, Е/мг білка·10-5 | Фериредуктаза, Нмоль Fe/мг кл ·хв |
L2 rib80 1022-31 hit 1-5 rib80hit - S18 rib80hit - S19 | 1.6 7.8 3.9 11.1 16.7 | 2.0 4.8 3.6 5.2 7.3 | 1.5 11.9 13.6 11.9 12.0 |
Підвищення біосинтезу РФ унаслідок поєднання в одному геномі двох мутацій було значно більшим, ніж могло б бути у випадку звичайного сумування дії кожної мутації зокрема.
Для мутантів rib80 та hit виявили характерні зміни в метаболізмі й транспорті заліза [3, 9]. У них вища, порівняно з диким типом, швидкість відновлення та поглинання клітинами іонів цього металу. Фериредуктазна активність клітин мутантів rib80hit була на рівні вихідних штамів (табл.3).
Висловлено припущення [5], що у P.guilliermondii репресором флавіногенезу є олігомерний білок, у склад якого входять іони Fe(II) і продукти генів RIB80 та RIB81. Об’єднання мутацій rib80 і rib81 змінює активність репресора і спричиняє значне зростання флавіногенної активності і збільшення швидкості транспорту заліза в клітину [7]. Ген HIT, який бере участь у поглинанні й акумуляції заліза, контролює також біосинтез РФ. Отримані нами результати свідчать про те, що об’єднання в одному геномі дріжджової клітини дефектних генів RIB80 і HIT призводить до зростання флавіногенної активності, проте не змінює активності ключового ферменту транспорту заліза - фериредуктази. Можливо, що в контролі транспорту заліза беруть участь, крім генів RIB80, RIB81 і HIT, інші специфічні фактори регуляції, які підтримують вміст заліза в клітині на нетоксичному рівні. Зростання флавіногенної активності при об’єднанні мутацій rib80 і rib81, rib80 і hit свідчить про існування у P. guilliermondii регуляторних елементів складної структури, що контролюють біосинтез РФ на генному рівні. Подібні регуляторні елементи, які взаємодіють за типом синергізму, описані у Saccharomyces cerevisiae [12].
___________________
1. Логвиненко Е.М., Шавловский Г.М., Закальский А.Е., Заходыло И.В. Влияние железа, актиномицина Д и циклогексимида на синтез ГТФ-циклогидролазы у флавиногенных дрожжей // Биохимия . 1982. Т.47.№1.С.28-33.
2. Логвиненко Е.М., Шавловский Г.М., Трач В.М. и др. Исследование роли флавинов в регуляции синтеза рибофлавинсинтетазы у дрожжей Pichia guilliermondii и Candida utilis // Микробиология. 1973. Т.42. .№6. С.1008-1013.
3. Стенчук Н.Н., Протченко О.В., Федорович Д.В., Шавловский Г.М. Мутанты Pichia guilliermondii с повышенной способностью к восстановлению рибофлавина и ионов железа // Генетика. 1991. Т.27. .№3.С.561-564.
4. Шавловский Г.М., Жарова В.П., Щелокова И.Ф. и др. Флавиногенная активность природных штаммов дрожжей Pichia guilliermondi // Прикл. биохимия и микробиолия. 1978. Т.14. Вып.2. С.184-189.
5. Шавловский Г.М., Логвиненко Е.М. Роль железа в регуляции синтеза белков у микроорганизмов // Успехи микробиол. 1988. Т.29. С.108-133.
6. Шавловский Г.М., Сибирный А.А., Кшановская Б.В. и др. Генетическая классификация рибофлавинзависимых мутантов дрожжей Pichia guilliermondii // Генетика.1979.Т.15.С.1561-1568.
7. Шавловський Г.М., Стенчук М.М., Федорович Д.В., Куцяба В.І. Про взаємодію факторів негативного контролю біосинтезу рибофлавіну у дріжджів Pichia guilliermondii // Доповіді АН України.1994. .№10. C.138-140.
8. Шавловский Г.М., Федорович Д.В., Бабяк Л.Я. Влияние мутации rib81 на биосинтез рибофлавина и транспорт железа у дрожжей Pichia guilliermondii // Микробиология.1993.Т.62. .№5.С.897-903.
9. Шавловский Г.М., Федорович Д.В., Куцяба В.И. и др. Участие гена RIB80 в регуляции биосинтеза рибофлавина и транспорта железа у Pichia guilliermondii // Генетика. 1992.Т.28. .№9.С.25-32.
10. Шавловский Г.М., Федорович Д.В., Логвиненко Е.М., Колтун Л.В. Выделение и характеристика флавиногенных штаммов Pichia guilliermondii, несущих регуляторную мутацию rib80 (ribR) // Микробиология.1985.Т.54.Вып.6. С.919-926.
11. Lesuisse E., Raguzzi F., Crichton R.R. Iron uptake by the yeast Saccharomyces cerevisiae: Involvement of a reduction step // J. Gen. Microbiol. 1987.Vol.133.P.3229-3236.
12. Struhl K. Molecular mechanisms of transcriptional regulation in yeast// Ann. Rev. Biochem.1990.Vol.58. P.1051-1077.