ВПЛИВ ІНТЕРМЕДІАТІВ ЦИКЛУ КРЕБСА НА ПОСТРАДІАЦІЙНІ ЗМІНИ ПРОЦЕСІВ ДИХАННЯ Й ОКИСНОГО ФОСФОРИЛУВАННЯ У МІТОХОНДРІЯХ ПЕЧІНКИ ЩУРІВ
Н. Кургалюк, О. Горинь, О. Іккерт, С. Гордій
Львівський національний університет імені Івана Франка
вул.Грушевського, 4, 79005 Львів, Україна
Одним з можливих шляхів фізіологічного впливу на резистентність організму до дії іонізуючої радіації є корекція енергетичних процесів на субклітинному рівні. Субстрати циклу трикарбонових кислот (ЦТК) привернули увагу дослідників з метою застосування природних для організму та високоефективних сполук у радіобіологічних дослідженнях. Передусім як радіопротектор використовується сукцинат натрію (СК), що має здатність нормалізувати різноспрямовані відхилення, спричинені радіаційним впливом [1]. Виявлені у нашій лабораторії радіотерапевтичні властивості іншого інтермедіата ЦТК – альфа-кетоглутарату натрію (КГН) [2, 3, 4] - спрямували подальші дослідження з метою розробки шляхів корекції функцій енергозабезпечення мітохондрій травних залоз опромінених тварин.
Нашою метою було дослідження впливу головних інтермедіатів ЦТК (КГН, СК) та їхніх комбінацій зі сполуками, що у метаболізмі тісно пов’язані з циклом (КГН і малат), (СК і глутамат) на пострадіаційні зміни стану мітохондріального дихання й окисного фосфорилування, процесів переамінування, сукцинатдегідрогеназної активності (СДГ) тканини печінки у процесі опромінення щурів малими дозами.
Дослідження виконували на 120 нелінійних білих щурах-самцях масою 200-220 г. Тварин опромінювали щоденно рентгенівськими променями на апараті РУМ-17 дозою 1Р до досягнення сумарних доз опромінення 10 (10 діб), 20
(20 діб) та 30 Р. Умови опромінення: напруга - 110 кV, струм - 4 mA, фільтр Cu - 0,5 і Al 1, відстань - 2 м, потужність дози - 0,2 Р/хв, час опромінення – 5 хв.
КГН, КГН і малат натрію, сукцинат і глутамат натрію вводили курсовими концентраціями по 20 мг/100 г маси тварини після досягнення зазначених сумарних доз опромінення. Отже, тварини першої групи отримали 20 мг препарату на 100 г маси, другої – 40 мг і третьої – 60 мг КГН на 100 г маси. Стосовно інших серій експерименту: тварини першої групи отримали 20 мг КГН і 20 мг малату натрію, другої – по 40 мг, а третьої – 60 мг препаратів відповідно. Аналогічно вводили сукцинат і глутамат натрію. Час дії препаратів після останнього введення становив 30 хв, після чого тварин декапітували. У кожній серії експерименту контролем були неопромінені щурі, яким вводили 1 або 2 мл фізіологічного розчину, та опромінені тварини, яким замість препаратів аналогічно вводили 0,9% хлорид натрію.
Мітохондрії (МХ) печінки виділяли за загальноприйнятими методами модифікацій, що дають змогу зберігати нативність ізольованих мітохондрій [4]. Видалений з декапітованих тварин орган зберігали протягом 10 хв у середовищі гомогенізації, охолодженому до появи плаваючих кристалів. Охолоджену тканину подрібнювали, пропускаючи через прес, і гомогенізували в гомогенізаторі Поттера-Евельгейма при швидкості обертів 300/хв і трьох вертикальних ходах товкачика. Середовище гомогенізації містило для печінки 260 мМ сахарози і 10 мМ трис-буфера (pH 7,4). З 8% гомогенату центрифугуванням поетапно осаджували фракцію ядер - 3 хв при 150 g і 4 хв при 300 g без зупинки центрифуги. Мітохондріальну фракцію отримували центрифугуванням супернатанту протягом 10 хв при 4500 g. Одержаний непромитий осад регомогенізували вручну (один вертикальний хід товкачика) з середовищем гомогенізації, яке додавали з розрахунку отримання суспензії МХ печінки з концентрацією 70-90 мг мітохондріального білка в 1 мл.
Дихання МХ реєстрували полярографічним методом за допомогою полярографа LP-7. Метод, обладнання полярографічної установки, вимірювальну комірку детально описано у праці [8]. Середовище інкубації для МХ печінки було таким (ммоль/л): сахароза – 150, KCl – 50, KH2PO4 – 1, тріс–буфер – 5 (pH 7,4). Субстрати окиснення: 1 мМ альфа-кетоглутарат; 0,5 мМ сукцинат; суміш субстратів: 3 мМ глутамат та 2,5 мМ малат і 4 мМ піруват та 3 мМ глутамат. Також використовували 2 мМ малонат та 1 мМ амінооксиацетат. Як акцептор фосфату – аденозиндифосфат (АДФ) (200 мкМ). Метод, який застосовується, дає змогу ідентифікувати метаболічні стани МХ за Чансом [11]. Визначали такі показники дихання МХ: V3 – швидкість фосфорилувального дихання після додавання АДФ та V4 – швидкість контрольованого дихання МХ, АДФ/0 –коефіцієнт фосфорилувального дихання, АДФ/t – швидкість фосфорилування АДФ.
Активність ферментів перамінування (аланін- та аспартатамінотрансферази) визначали методом Осадчої [7]. Активність СДГ – спектрофотометричним методом Єщенка,Вольського [2]. Уміст білка визначали методом, описаним у праці [15]. Результати досліджень аналізували методом варіаційної статистики за Стьюдентом.
З’ясували, що рентгенівське опромінення тварин сумарними дозами 10, 20 та 30 Р спричиняє неоднозначні зміни енергетичного забезпечення мітохондріальних процесів, якщо використовувати як субстрат окиснення КГН (1 мМ) і СК (0,5 мМ). Зокрема, показник АДФ-стимульованого дихання V3 (за Чансом), що виявився найбільш чутливим та інформативним, у процесі окиснення КГН після досягнення сумарної дози опромінення 10 Р вірогідно зростає. Зростає також на 31% значення дихального контролю, що характеризується співідношенням V3/V4 (за Чансом), та ефективність окисного фосфорилування (ОФ) - на 4% у процесі окиснення цього субстрату (табл. 1).
За цих умов зменшується час фосфорилування доданої АДФ. Тривалий іонізуючий вплив малими дозами призводить до збільшення швидкості окиснення СК у МХ, однак ці процеси супроводжуються зменшенням показників дихального контролю до 91% та ефективності використання кисню до 82% (p<0,05) щодо неопроміненого контролю (табл. 2). Це свідчить про тенденцію до зниження спряженості процесів дихання та ОФ під час опромінення цією дозою навіть у порівняно резистентних органах, таких як печінка. Ймовірно, така активація мітохондріального дихання, якщо використовувати субстрати дихання КГН і СК, є виявом адаптивної перебудови функцій організму на заподіяний патологічний вплив [5, 14].
Введення КГ після опромінення цією дозою не призводить до вірогідного зростанння АДФ-стимульованого дихання (V3). Однак такі зміни швидкості дихання у цій групі тварин відбуваються без роз’єднання процесів дихання та ОФ, бо показник дихального контролю збільшується на 3,2% у процесі окиснення КГН
Таблиця 1
Показники дихання та ОФ МХ печінки щурів унаслідок використання як субстрату окиснення альфа-кетоглутарату (1 мМ) після щоденного рентгенівського опромінення білих щурів дозою 1 Р та курсового введення КГН
Умови досліду | Дихальний контроль, V 3/V 4 | АДФ/О мкМ АДФ на нг . ат . О | АДФ/t мкМ АДФ/мг білка/с |
10 Р Контроль Опромінення Вплив КГН | 3,04 ± 0,15 3,98 ± 0,16* 4,11 ± 0,12 | 2,13 ± 0,11 2,21 ± 0,03 2,34 ± 0,12 | 2,03 ± 0,10 1,80 ± 0,13 2,44 ±0,07** |
20 Р Контроль Опромінення Вплив КГН | 4,31 ± 0,73 3,58 ± 0,26 3,74 ± 0,16 | 2,10 ± 0,04 1,82 ± 0,06* 2,74 ± 0,13 | 2,41 ± 0,07 2,55 ± 0,14 2,71 ± 0,14 |
30 РКонтроль Опромінення Вплив КГН | 4,45 ± 0,1 3,69 ± 0,3* 4,57 ± 0,1** | 2,44 ± 0,04 2,01 ± 0,01* 2,21 ± 0,01** | 2,03 ± 0,09 1,80 ± 0,12 2,44 ± 0,06** |
* Достовірні зміни між опроміненням і контролем ( p<0,05);
** Достовірні зміни між опроміненям і введенням препарату
порівняно з опроміненим контролем. Збільшується також швидкість фосфорилування доданої АДФ на 35% (p<0,01) у випадку КГН і на 30,8% (p<0,01) для СК за цих умов. Ці значення дихального контролю і швидкості фосфорилування наближаються до меж неопроміненого контролю і навіть перевищують його як у процесі окиснення КГН, так і СК. Вводячи КГН опроміненим тваринам, виявили тенденцію до зростання показника ефективності ОФ, вираженої у процесі окиснення КГН і СК порівняно з опроміненим контролем. Відомо, що ефективність використання СК, що утворився в МХ з КГН, значно вища, ніж у випадку додавання у середовище полярографічної комірки [11]. Це свідчить про мобілізацію найефективніших субстратів дихання з метою генерації аденозинтрифосфорної кислоти у перші ж години пострадіаційного періоду.
Порушення механізмів ОФ простежували через 20 та 30 діб після ін’єкції опроміненим щурам фізрозчину, тобто досягнення сумарної дози опромінення 20 та 30 Р. Як свідчать дані, опромінення цією дозою зменшує АДФ-стимульоване дихання у процесі окиснення СК до 87,5 та 90,8% відповідно і дещо підвищує у процесі окиснення КГН наприкінці дослідження порівняно з неопроміненим контролем. Тобто система окиснення сукцинату виявилась чутливішою до ушкоджуючої дії тривалого іонізуючого впливу [1, 12].
У різні терміни після опромінення тварин простежували різке роз’єднання процесів дихання і фосфорилування, що розглядається як наслідок порушень транспорту електронів і протонів у дихальному ланцюгу, перенесення електронів від субстратів окиснення. Зокрема, за допомогою специфічних інгібіторів перенесення електронів, пов’язаних із запасанням енергії, досліджено, що у процесі опромінення пошкоджуються два пункти утворення макроергів під час окиснення сукцинату [9].
Таблиця 2
Показники дихання та окисного фосфорилування мітохондрій печінки щурів унаслідок використання як субстрату окиснення сукцинату (0,5 мМ) після щоденного рентгенівського опромінення білих щурів дозою 1 Р та курсового введення альфа-кетоглутарату натрію
Умови досліду | Дихальний контроль, V3/V4 | АДФ/О мкМ АДФ на нг . ат. О | АДФ/t мкМ АДФ/ мг білка/с |
10 Р Контроль Опромінення Вплив КГН | 3,48 ± 0,21 3,18 ± 0,30 3,04 ± 0,22 | 1,70 ± 0,05 1,40 ± 0,04* 1,53 ± 0,09 | 2,64 ± 0,36 2,40 ± 0,11 3,14 ±0,12** |
20 Р Контроль Опромінення Вплив КГН | 2,95 ± 0,1 2,69 ± 0,6 2,89 ± 0,05 | 1,63 ± 0,09 1,38 ± 0,06* 1,72 ± 0,01** | 2,03 ± 0,11 1,80 ± 0,12 2,44 ± 0,06 |
30 Р Контроль Опромінення Вплив КГН | 2,99 ± 0,42 2,75 ± 0,31 2,68 ± 0,12 | 1,74 ± 0,04 1,03 ± 0,05* 1,51 ± 0,12** | 2,03 ± 0,1 2,11 ± 0,09 2,43 ± 0,07** |
* Достовірні зміни між опроміненням і контролем ( p<0,05);
** Достовірні зміни між опроміненям і введенням препарату
У згадані терміни експерименту (20, 30 Р) зменшується також показник дихального контролю до 83 та 82% (p<0,01) у процесі окиснення КГН відповідно і до 92% у двох випадках під час окиснення СК, що свідчить про розспряження процесів дихання і фосфорилування. Ефективність доданої АДФ зменшилась за цих умов суттєво і становила всього 87 та 82%, коли як субстрат окиснення використовували КГН. Стосовно системи окиснення СК виявили, що АДФ/О вірогідно зменшується у випадку досягнення сумарних доз опромінення 20 та 30 Р: до 84 та 60% порівняно з групою опромінених тварин. Це свідчить про поглиблення порушень процесів утворення макроергів у МХ, а рівнозначне сповільнення процесів АДФ-стимульованого дихання у процесі окиснення як НАД-, так і ФАД-залежних субстратів, ймовірно, є наслідком деструктивних порушень у самих органелах після опромінення.
Після застосування КГН у ці терміни дослідження простежували підвищення енергетичного обміну під час окиснення досліджуваних субстратів порівняно з групою тварин, яким препарат не вводили. Це виявлялось у збільшенні швидкості АДФ-стимульованого дихання та показника дихального контролю, що свідчить про нормалізацію спряженості дихання і фосфорилування, супроводжується збільшенням швидкості фосфорилування доданої АДФ порівняно з групою опромінених тварин. Зокрема, для СК АДФ/t збільшується на 36% (p<0,01) порівняно з опроміненими тваринами. Курсове застосування КГН та малату натрію не призводило до статистично достовірних змін показників дихання, які були неоднозначними.
Відомо, що у процесі окиснення доданого КГН, особливо стимульованого АДФ, певний внесок у споживання кисню робить окиснення в МХ ендогенного, а також генерованого з КГН сукцинату. Тому для виявлення “чистого” внеску в окисненні КГН саме КГН у всі терміни експерименту досліджували фосфориловане дихання за наявності інгібітора СДГ – малонату. З’ясували, за наявності КГН і малонату у полярографічній комірці на 30 добу дослідження у тканині опромінених тварин стимуляція АДФ-залежного дихання становить 4,9% щодо значень неопроміненого контролю, за умов курсового застосування КГ цей ефект виражений сильніше – 37,5% (p<0,05) щодо опромінених щурів.
Виражена стимулювальна дія КГН на енергетичний обмін у МХ опромінених тварин можлива декількома шляхами. Одним з них є стимулювальний вплив на окиснення суміші глутамату (3мМ) з малатом (2,5 мМ) (134%, (p<0,01), глутамату (3 мМ) з піруватом (4мМ) (124,1%, (p<0,05) порівняно з групою опромінених тварин, що ми виконували на 30-ту добу дослідження. Це призводило до утворення ендогенного КГН в амінотрансферазних реакціях і підвищення пов’язаного з цим анаболічного обміну. Зазначимо, що інгібітор переамінування амінооксиацетат (1 мМ), який вводили у полярографічну комірку із субстратом окиснення СК (0,5 мМ), у МХ опромінених тварин за умов дії КГН вірогідно зменшував швидкість фосфорилованого дихання, дихальний контроль та коефіцієнт ефективності фосфорилування АДФ/О на 20-ту та 30-ту добу експерименту. У інших серіях досліду вірогідних змін досліджуваних значень не виявили. Це свідчить про важливу роль реакцій переамінування у реалізації дії екзогенного КГН на фоні обмеження симпатоадреналового механізму регуляції, що у підсумку призводить до економізації енергозатрат на процеси відновлення і репарації в опроміненому організмі [10, 13].
Таблиця 3
Зміни активності аланін- , аспартатамінотрансфераз та сукцинатдегідрогенази тканини печінки після щоденного рентгенівського опромінення білих щурів дозою 1 Р та курсового введення КГН
Умови досліду | Аланінаміно- трансфераза, мкмоль пірувату, г/год | Аспартат- Амінотрансфераза, мкмоль пірувату, г/год | Сукцинатдегідрогеназа нмоль сукцинату, мг білка/хв |
10 Р Контроль Опромінення Вплив КГН | 1046 ± 28 978 ± 34 1256 ± 21** | 1142 ± 11 1176 ± 13* 1234 ± 32 | 11,14 ± 0,23 13,8 0 ± 0,20* 8,10 ±1,1** |
20 Р Контроль Опромінення Вплив КГН | 988 ± 13 876 ± 21 1245 ± 43** | 835 ± 13 978 ± 15* 1043 ± 21** | 12,03 ± 0,29 14,33 ± 0,14* 7,21 ± 0,21** |
30 Р Контроль Опромінення Вплив КГН | 1024 ± 17 876 ± 18* 913 ± 0,13 | 938 ± 32 765 ± 21* 902 ± 34** | 10,12 ± 0,33 11,61 ± 0,33* 9,31 ± 1,23** |
* Достовірні зміни між опроміненням і контролем ( p<0,05);
** Достовірні зміни між опроміненям і введенням препарату
Про це свідчить також пряме вимірювання активності ферментів переамінування та СДГ у тканині печінки (табл.3). Відомо, що різке зростання активності СДГ свідчить про інтенсивне включення СК в енергозабезпечення, що характерно для напруженої життєдіяльності клітин під впливом екстремальних факторів [3, 4]. Уже з перших термінів пострадіаційного періоду пошкоджуються шляхи швидкого постачання найефективніших субстратів дихання на фоні дефіциту енергопостачання [1]. Про це свідчить той факт, що активації амінотрансферазних реакцій ми не виявили у процесі курсового застосування комбінацій препаратів сукцинату і глутамату натрію, а дослідили зростання активності СДГ на фоні зниження антиоксидантого захисту та активації процесів перекисного окиснення ліпідів за цих умов.
Відомо, що окиснення КГН у МХ пов’язується не тільки з окисним фосфорилуванням, але й фосфорилюванням на рівні субстрату й утворенням гуанозинтрифосфату, що змінює співідношення цАМФ/цГМФ. Зменшення цього показника переводить організм на переважне здійснення холінергічних регуляторних впливів та сприяє підвищенню резистентності особин до опромінення і виживання [6, 12]. Сукцинат і глутамат натрію обмежують холінергічні впливи в опромінених тварин, активують окиснення сукцинату, яке, проте, відбувається зі зменшенням значень дихального контролю та ефективності використання кисню для синтезу макроергів.
___________________
1. Дворецкий А.И., Айрапетян С.И., Шаинская А.М., Чеботарев Е.Е. Трансмембранный перенос ионов при действии ионизирующей радиации. К. 1990.
2. Ещенко Н.Д., Вольский Г.Г. Определение количества янтарной кислоты и активности сукцинатдегидрогеназы // Методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен). Л., 1982. С.207-212.
3. Ивницкий Ю.Ю., Штурм Р. Защита мышей от рентгеновского излучения сукцинатом натрия // Радиобиология. 1990. Т.80. Вып.5. С.704-706.
4. Кондрашова М.Н., Григоренко С.В. Проявление стресса на уровне митохондрий, их стимуляция гормонами и регуляция гидроаэроионами // Журн.общ.биол. 1985. Т.36. №4. С.516-526.
5. Кургалюк Н.М., Шостаковська І.В., Доліба М.М. Вплив екзогенного альфа-кетоглутарату натрію на резистентність щурів до іонізуючого опромінення // Проблеми Чорнобильської зони відчуження. 1997. Вип.5. С.151-154.
6. Лозинская И.И., Никифорова Н.А., Москаленко И.П. Индивидуальные пострадиационные реакции циклических нуклеотидов в лифоидных клетках селезенки крыс // Радиобиология. 1992 Т.32. Вып.4. С.534-539.
7. Осадчая Л.М. Определение активности аминотрансфераз в тканях // Методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен). Л., 1982. С.246-250.
8. Руководство по изучению биологического окисления полярографическим методом. М., 1973.
9. Чеботарев Е.Е., Барабой В.А., Дружина В.А. и др. Окислительные процессы при гамма-нейтронном облучении организма. К., 1986. .
10. Шостаковська І.В., Кургалюк Н.М., Бергтраум Д.І., Доліба М.М. Вплив парентерального введення a-кетоглутарату на резистентність щурів до іонізуючого опромінення та холінергічну систему їх організму // Фізіол.журн.1999. Т.45. №1-2. С.119-126.
11. Chance B., Williams G. The respiratory chain and oxidative phosphorylation // Adv. Enzymol. 1956. Vol.17. P.65-134.
12. Kurgaluyk N.M, Shostakovska I.V. Influence of sodium alpha-ketoglutarate injection on energy support of digestive glands by functional loading of the organism // Materials of 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology, 1997, San - Francisco, 1997. P.179.
13. Kurgalyuk N.M. Investigation of indices of energetical exchange in digestive glands and myocard of rats with different hypoxia resistance // 9th European Bioenergetics Conference. EBEC short reports. 1996. Vol.9. P.179.
14. Kurgalyuk N.M., Goryn O. Modulation of rats digestive glands resistance to action of ionizing radiation by means of sodium alpha-ketoglutarate // BioThermoKinetics in The Post Genomic Era. Chalmers Reproservice. Goteborg, 1998. P.329-331.
15. Lowery O.H., Rosenbrough N., Farr A.L., Randall R.I. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J.Biol.Chem. 1951. Vol.193. №1. P.265-275.