КІНЕТИКА КИСЛОТНОГО ЛІЗИСУ ЕРИТРОЦИТІВ РІЗНИХ ВІКОВИХ ПОПУЛЯЦІЙ ЗА НАЯВНОСТІ ЛІГАНДІВ ДЕЯКИХ ІНТЕГРАЛЬНИХ БІЛКІВ ПЛАЗМАТИЧНИХ МЕМБРАН

О. Трикуленко, У. Пінішко, Л. Дацюк

Львівський національний університет імені Івана Франка,

вул. Грушевського, 4, м. Львів 79005, Україна,

e-mail: biolog@franko.lviv.ua

 

Лізис еритроцитів у кислотному середовищі включає три основні стадії: про­никнення йонів водню через плазматичну мембрану, протонування гемоглобіну, й, як наслідок цього, осмотичне руйнування червоних клітин [7]. Існують експери­ментальні дані, згідно з якими, на завершальній стадії цього процесу суттєвого значення набуває денатурація та наступна агрегація мембранних білків [4]. Оче­видно, що взаємодія цих білкових молекул з специфічними лігандами, які стабі­лізують їх просторову будову, суттєво впливатиме на їхню здатність до агрегації та денатурації у кислотному середовищі і, так забезпечувати зміну кінетики лізису еритроцитів на завершальній його стадії. Так, преінкубація нефракціонованих ери­троцитів периферичної крові з лігандами таких мембранних білків, як ацетилхолі­нестераза, білок смуги 3,ß-адренорецептор, викликає суттєві зміни кінетики їх кислотного лізису [9].

Оскільки нефракціоновані еритроцити периферичної крові є сукупністю клі­тин, терміни перебування яких у кров’яному руслі різні, метою нашої праці було з’ясувати, еритроцити яких вікових популяцій є найчут­ливішими до дії лігандів згаданих вище мембранних білків.

Експерименти проводили на безпородних білих щурах-самках масою 160–220 г. Гепаринізовану кров центрифугували, отримані еритроцити тричі відмивали 0,1 М фосфатним буфером, рН 7,4, який готували на 0,86 % NaCl, Одержані чер­воні клітини фракціонували на колонці в градієнті густини сахарози [8]. Еритро­цити кожної отриманої фракції відмивали ще раз у тому ж самому буфері й вико­ристовували для дослідження кислотної резистентності за методом Гітельзона та Терскова [2]. Преінкубацію червоних клітин із ацетилхоліном (2,5 mМ [1]) та пропранололом (12,7 mkM [3]) проводили безпосередньо в термостатованій кюветі упродовж 2 та 10 хв. відповідно перед додаванням гемолізуючого розчину.

Преінкубацію з акридином проводили , як це описано в праці [11]: відмиті еритроцити з 10% гематокритом суспензували в суміші, яка містила 10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 5 mM глюкози, 1 mM акридину, рН 7,4, час інкубації 15 хв.

Проведені дослідження виявили, що найбільшу стабільність у кислотному се­редовищі мають молоді еритроцити, а знижену – старі червоні клітини. Зрілі ерит­роцити мають проміжну кислотну резистентність. При інкубації препаративно ви­ділених на колонці молодих червоних клітин із ацетилхоліном виявлено два типи еритрограм. Частина кривих зсунута праворуч, інші – подібні до еритрограм конт­рольних тварин. Однозначний ефект преінкубації з ацетилхоліном виявлено на зрілих популяціях червоних клітин: усі одержані криві гемолізу зміщені праворуч порівняно з нормою (рисунок а).Тривалість сферуляції еритроцитів при цьому залишається без змін, а зсув профілю еритрограм свідчить про те, що впливу ліган­да піддаються еритроцити всієї цієї популяції. Як відомо, мембранна ацетилхо­лі­нестераза разом із білками смуги 3 створює надмоле­кулярний комплекс перене­сення аніонів через еритроцитарну мембрану. Було виявлено, що преінкубація мебран еритроцитів з ацетилхоліном, у насичуючих фермент концентраціях, вик­ликає конформаційні зміни ацетилхолінестерази, що, насамперед спричиняє зміни характеру білок-білкових взаємодій між їншими субоди­ницями цього комплексу [6]. Досліджено, що цей ефект ацетилхоліну дуже впливає на кінетику лізису за­гальної популяції червоних клітин [9]. Отримані дані в цьому дослідженні свід­чать, що мембранно-конформаційні пе­реходи, які індукуються взаємодією аце­тилхолінестерази із специфічним лігандом, наявні здебільшого в плазматичних мембранах зрілих еритроцитів. Відсутність значного впливу ацетилхоліну на кіне­тику лізису молодих і старих популяцій можна пояснити тим, що ступінь асоціації ацетилхолінестерази з іншими білками надмолекулярного комплексу – аніонного каналу в мембранах цих клітин суттєво відрізняється порівняно із зрілими клі­тинами. Як відомо, білки смуги 3 у мембрані еритроцита можуть перебувати як у вільному стані, так і в зв’язаному з іншими білками. Наприклад, вибіркове зв’язу­вання білків смуги 3 гліцеральдегідфосфат-дегірогеназою або фруктозо-біс-фос­фат- альдолазою, які локалізовані на внутрішній поверхні цитоплазма­тичної мембрани еритроцита, сприяє їхній олігомеризації [5]. Можна припустити, що й ацетилхолінестераза, яка локалізована на зовнішньому боці мембрани еритроцита, також полегшує асоціацію білків смуги 3 у плазматичних мембранах зрілих чер­воних клітин. У популяції старих клітин, унаслідок зміни їхньої форми, можуть виникнути умови для дисоціації комплексів, які складаються з білків смуги 3 та aцетилхолінестерази, внаслідок чого конформаційні переходи, які індукуються ацетилхоліном не проявляються. На користь цього припущення свідчать дані про зміну конформаційного стану білків смуги 3 при старінні еритроцитів [10].

             Типові кислотні еритрограми різновікових популяцій еритроцитів в нормі та за наявності лігандів деяких інтегральних білків: а – кислотні еритрограми зрілих еритроцитів периферичної крові за наявності (1) та відсутності (2) ацетилхоліну; б – кислотні еритрограми старих еритроцитів периферичної крові за наявності (1) та відсутності (2) пропранололу; в – кислотні еритрограми молодих еритроцитів пери­феричної крові за наявності (суцільна лінія) та відсутності (пунктирна лінія) акридину

Раніше виявлено, що преінкубація нефракціонованих червоних клітин з бета-адреноблокатором пропрано­лолом викликає зміну параметрів кінетики їх лізису в кислотному середовищі [9]. Результати досліджень дали змогу встановити неодно­значний вплив преінкубації з пропранололом на кінетику кислотного лізису ерит­роцитів усіх вікових популяцій еритроцитів. Однак значний та однозначний вплив цього ліганда проявляється в процесі кислотного лізису тільки старих червоних клітин (рисунок, б). Тривалість сферуляції збільшується в середньому на 0,5 хв, максимум еритрограми зміщується по ординаті часу на 0,5–1,0 хв, висота його змен­шується. Як відомо, процес сферуляції еритроцитів у кислотному середовищі лімітується швидкістю транс­порту протонів всередину клітини [7] Тому отримані нами дані дають змогу припустити, що бета-адре­но­рецептор, з яким зв’язується пропранолол, є одним з білкових компонентів, формуючих систему пасивного транспорту протонів через мембрану еритроцитів. На користь цього припущення свідчать дані про вплив лі­гандів бета- адренорецепторів на Na+ – H+ – обмін у еритроцитах [6]. Не виключено, що в старих клітинах, на відміну від молодих та зрілих клітинних популяцій, значна, якщо не вся кількість молекул бета- адрено­рецепторів бере участь у форуванні каналів проникливості  для протонів.

Відомо, що акридин жовтогарячий викликає утворення в мембранах еритро­цитів білкових кластерів, до складу яких входить білок смуги 3 [11] Виявлено, що преінкубація нефракціонованих еритроцитів периферич­ної крові з акридином сильно впливає на кінетику їхнього кислотного лізису. Константа швидкості роз­паду еритроцитів при цьому знижується на 35,5% [9]. Очевидно, що кластеризація білків смуги 3 сприяє збільшенню стабільності червоних клітин до дії денату­руючого агента.

Дослідження впливу акридину на кінетику кислотного лізису еритроцитів різ­них вікових популяцій виявили, що однозначний і стабілізуючий ефект цієї сполу­ки знаходить свій прояв на фракції молодих червоних клітин (рисунок, в) – про­філь еритрограми зсувається праворуч відносно профілю контрольної кривої лізису. Преінкубація з акридином зрілих та старих клітинних популяцій еритро­цитів мало позначається на кінетиці їхнього кислотного лізису. Очевидно це пояс­нюється тим, що кількість “вільних” молекул білка смуги 3, здатних при взаємодії з акридином утворювати кластери, в мембранах цих клітин значно менша, ніж у мембранах молодих клітин.

Отже, проведені дослідження виявили, що акридин, який сприяє утворенню кластерів білка смуги 3 значно впливає на кінетику лізису переважно молодих еритроцитів, ацетилхолін – на швидкість розпаду зрілих чер­воних клітин, а b-адреноблокатор пропранолол – здійснює свій вплив на кінетику лізису переважно старих клітин.

____________________

 

1.                    Волотовский И.Д., Финин В.С., Конев С.В. Роль ацетилхолинэстеразы в транс­мембранном переносе анионов в эритроците // Биофизика. 1979. Т. 24. Вып. 1 .С. 21–27.

2.                    Гительзон М.И., Терсков И.А. Эритрограммы как метод клинического иссле­дования крови. Красноярск, 1954.

3.                    Голенда И.Л., Никулина Т.В., Голенда А.М. Комбинированный способ анализа эритроцитов // Клиническая лабораторная диагностика. 1992. №3–4. С. 27‑31.

4.                    Иванов И.Т., Данилова Ю.Д. Агрегация денатурированных мембранных бел­ков – начальный этап кислотного гемолиза // Биофизика. 1991.Т. 36. Вып. 5. С. 839– 843.

5.                    Курганов Б. И. Адсорбция периферических ферментов олигомерными якор­ными белками // Биол. мембраны.1984. Т.1. Вып. 4. С. 363–37.

6.                    Орлов С.Н., Скрябин Г. А., Котеловцев С.В. и др. Транспорт одновалентних ионов в еритроцитов карпа: механизм и регуляция // Биол. мембраны. 1989. Т.6. Вып. 12. С. 1261–1277.

7.                    Поэтова В.Т., Гительзон И. И., Терсков И.А. Вопросы биофизики, биохимии и патологии эритроцитов. М., 1967.

8.                    Сизова И. А., Каменская В.В., Феденко В.И. Безаппаратный способ фракцио­нирования клеток крови в градиенте плотности сахарозы // Изв. СО АН СССР. Сер. биол. наук. 1980. Т. 15. Вып. 3. С. 119–122.

9.                    Трикуленко А.В., Пинишко У.В., Панкевич Г.Л. Кинетика кислотного лизиса эритроцитов в присутствии лигандов некоторых интегральных белков плаз­матических мембран // Биофизика. 1996. Т. 41. Вып. 6. С. 1275–1277.

10.                 Passow H., Bartel D., Lepke S et al. Anion transport in the red blood cell of mouse // Struct. Funct. and Biogenesis Energy Transfer Syst. Proc.Int.Sump. Bari., 9-11 July, 1989.-Amsterdam ets. 1990. P. 227–233.

11.                 Turrini F., Arese P,.Yuan I. et al. Clustering of integral membrane proteins of the human erythrocyte membrane desposition and phagocytosis //J, Biol. Chem. 1991.Vol. 266. N35. P. 23611–23617.