УДК

ВПЛИВ ПЛАЗМИ КРОВІ ТВАРИН, ПОПЕРЕДНЬО АДАПТОВАНИХ ДО ГIПОКСIЇ, НА ВМІСТ 2,3 – БІФОСФОГЛІЦЕРАТУ В ЕРИТРОЦИТАХ IНТАКТНИХ ЩУРIВ

В. Коробов

Львівський національний університет імені Івана Франка,

вул. Грушевського, 4, м. Львів 79005, Україна,

e-mail: biolog@franko.lviv.ua

Cучасні уявлення в розумінні фізіологічної ролі гемоглобіну (Hb) нерозривно пов’язані з відкриттям інтраорганних механізмів регуляції його спорідненості до кисню (СГК), відкритих і детально описаних Борисюком М. В. [1]. Відомо, що СГК залежить від функціонального стану еритроцитів, ступеня активності гліколізу й пентозофосфатного циклу, вмісту й внутрішньоклітинного розподілу 2,3-БФГ, що, насамперед визначається характером мікрооточення циркулюючих у кровоплині червонокрівців [2]. Концентрація і природа факторів мікрооточення червоної клітини крові є змінними й залежать від інтенсивності й спрямованості метаболічних процесів. Питання про фактори, що оточують еритроцит, здатні викликати метаболічні зміни, не проникаючи в клітину, дискусійні й недостатньо вивчені. Тому метою цієї роботи стало виявлення і з’ясування природи циркулюючих у крові факторів, здатних впливати на функціональний стан еритроцитів.

У роботі використовували білих безпородних щурів-самців, масою 180–200 г. Гіпоксичну гіпоксію викликали, поміщаючи тварин у проточну барокамеру, де створювали рО₂ 56 мм рт. ст., що відповідає висоті 7000 м над рівнем моря. Тварини перебували у камері щоденно по 4 год упродовж 30 діб. Кров брали із сонної артерії й вени у тварин, яких перед цим наркотизували нанбуталом. 2,3–БФГ визначали за [3]. Визначення вмісту МСМ у плазмі крові проводили за методом [8]. МСМ піддавали гель-хроматографії на сефадексі G–15 (“Pharmacia”, Швеція). Дактилографічний аналіз проводили за Інгремом [10].

З поданих у табл. 1 даних видно, що 40-хвилинна інкубація еритроцитів інтактних щурів у плазмі крові тварин, адаптованих до переривчастої гіпоксії протягом 30 діб, викликає збільшення вмісту 2,3–БФГ (табл. 1). Причому фактори артеріальної плазми крові адаптованих до гіпоксії тварин, сприяють інтенсивнішому накопиченню 2,3–БФГ, ніж фактори венозної крові цих же тварин. Проявляється неоднозначність впливу факторів щодо розподілу 2,3–БФГ мембраною і зв’язаною формою з гемоглобіном. Так, якщо співвідношення (2,3-БФГ мембран)/(2,3–БФГ Hb) при інкубації червонокрівців у артеріальній плазмі, адаптованих до гіпоксії щурів становить 1.164, то при інкубації у венозній плазмі цих же тварин – 1.33. Пiдвищення концентрацiї 2,3–БФГ в еритроцитах, очевидно, пов’язане з тим, що в кровi тварин, адаптованих до гiпоксiї, циркулюють фактори, якi сприяють перебудовi вуглеводного обмiну. Про швидку інтенсифікацію гліколізу в еритроцитах in vitro свідчать дані літератури. Наприклад, Рубенштейн та співавтори [11] спостерiгали швидке трикратне збiльшення 2,3–БФГ, витримуючи еритроцити донорiв у iнкубацiйнiй сумiшi, яка мiстить аденiн, пiруват, глюкозу, iнозит i фосфат неорганiчний.

Виникає питання про механізм активації гліколітичних процесів у еритроцитах, як у зв’язку з цим про вміст основного регулятора афінності Hb до кисню – 2,3–БФГ.

Таблиця 1

Вміст 2,3-БФГ в еритроцитах, інкубованих у плазмі крові тварин, попередньо адаптованих до гіпоксії, мкмоль/мл еритроцитів (М ± m)

Умови експерименту	Загальний 2,3–БФГ	2,3-БФГ, зв’язаний з Hb	2,3-БФГ, зв’язаний з мембраною
Контроль	6.56±0.08	3.80±0.04	2.85+0.04
Плазма з артерії	7.90.25	4.20±0.1	3.68±0.13
Плазма з вени	8.3±0.18*	5.35±0.21	3.08±0.08

* Різниця вірогідна порівняно з контролем, р < 0.05

Серед кандидатів на роль факторів мікрооточення, що здатні регулювати морфофункціональний стан мембрани еритроцита, можуть бути молекули середньої маси (МСМ). Ці молекули мають чітко виражену біологічну активність і накопичуються в біологічних рідинах організму під впливом стресових факторів і при низці патологій [4, 8]. Горошинська і співавтори [5] cпостерігали кратне 1,5 зростання вмісту пептидного компоненту середніх молекул крові після 40 сеансів перервної гіпобаричної гіпоксії, коли в камері упродовж 5 годин створювався тиск тиск O₂, який відповідав висоті 4000 м над рівнем моря. Важливо те, що ці молекули впливають на йонну проникність мембрани [9].

Досліджуючи вміст молекул середньої маси щурів, ми показали, що за умов гіпоксичного стресу рівень цих сполук у плазмі крові зростає (табл. 2).

Таблиця 2

Вміст МСМ у плазмі крові щурів у нормі та при гіпоксичній гіпоксії, г/л (M±m)

Варіанти досліду	PO₂ у барокамері
Варіанти досліду	56 мм рт.ст.	26 мм рт.ст.
Інтактні тварини (n = 22)	0.63±0.02	0.63±0.02
Тварини, які піддавалась дії гіпоксичної гіпоксії (n = 6)	1.20±0.08*	1.54±0.11*

* Різниця між контролем і дослідом достовірна, р < 0.05

Причому виявлена пряма залежність між вмістом МСМ і розрідженням повітря, яким дихають. Описані кількісні зміни супроводжуються якісними, про що свідчать результати ексимерної хроматографії (рисунок).

Профіль елюції МСМ плазми крові інтактних (1) та підданих гіпоксичній гіпоксії (2) щурів із колони, упакованої сефадексом G75

Профіль елюції МСМ має шість піків. Під впливом гіпоксичного стресу, індукованого 30-хвилинним перебуванням щурів у барокамері, де створювався рО₂ 26 мм рт. ст. у профілі елюції МСМ спостерігається тенденція до розділення пептидного матеріалу у першій фракції. Зростає вміст молекул середньої маси у фракції № 2, а в області, яка відповідає об’єму виходу низькомолекулярних пептидів з’являється додаткова фракція, позначена на рисунку, яка відповідає за об’ємом виходу молекулярній масі 16000. Після дактилографічного аналізу цієї фракції встановлено що вона містить 6 пептидів. Чотири з них локалізуються у нейтральній зоні і 2 у катодній зоні. Амінокислотний склад пептиду з найвищою серед пептидів нейтральної зони розчинністю збігається з амінокислотним складом триптичному пептиду (1–16) гемоглобіну людини. Аналогічний пептид був виявлений Кареліним і співавт. у супернатанті культури еритроцитів людини [7]. На думку авторів, такого типу пептидний матеріал може бути результатом постадійного протеолізу гемоглобіну. Оскільки цей пептид виявлений серед пептидного матеріалу плазми крові, його поява зумовлена здатністю еритроцита секретувати продукти гідролізу гемоглобіну. Молекулярна маса виявленого серед молекул середньої маси пептиду становить 1664, тобто він не відноситься до фракції гемолізату непептидної природи. Цей пептид входить до групи фраґментів протеолізу гемоглобіну, які володіють еритропоетичною [6]. До цієї групи пептидів відносяться фраґменти (1–12), (1–10), (1–11), (1–10), (72–85).

Оскільки мультиферментний комплекс, який містить фосфогліцератмутазу, асоційований з мембраною еритроцита, ймовірно, що швидка активація ферменту, який каталізує утворення 2,3–БФГ, зумовлена прямою дією певних фраґментів МСМ пептидної природи з еритроцитарною мембраною. Враховуючи, що пул пептидних фракцій МСМ постійно змінюється і визначається метаболічним станом як формених елементів, так і клітин тканин, з яких вони потрапляють у кровоплин, слід очікувати неперервної зміни модуляції гліколітичних процесів у червонокрівцях при циркуляції крові.

______________________

1. Борисюк М.В. Системный анализ механизмов регуляции сродства крови к кислороду. І. Внутриэритроцитарная регуляция сродства гемоглобина к кислороду // Успехи физиол. наук. 1983. Т. 14. № 1 С.85–101.

2. Борисюк М.В. Системный анализ механизмов регуляции сродства крови к кислороду. ІІ. Особенности регуляции кислородсвязующих свойств крови в процессе ее циркуляции // Успехи физиол. наук. 1984. Т. 15. № 2.С. 3–26.

3. Виноградова И.Л., Багрянцева С. Ю., Дервиз Г.В. Неферментный метод опредиления 2,3-дифосфоглицериновой кислоты в еритроцитах // Лаб. дело. 1976. № 8. С. 490–493.

4. Гордиева И.П. Определение степени интоксикации у детей с хирургическими гнойно-септическими заболеваниями // Хирургия. 1986. № 8. С. 27–29.

5. Горошинская И.А., Виноградов А.Ю., Лукаш А.И. Влияние пиразидола на содержание молекул средней массы при разных режимах гипобарической гипоксии // Вопр. мед. химии. 1994. Т. 40. № 4. С. 19–21.

6. Иванов В.Т., Карелин А.А., Михеева И.И., Васьковский Б.Ф., Свиряев В.И., Назимов И.В. // Биоорганическая химия. 1992. Т. 18. C. 1271–1311.

7. Карелин А.А., Филиппова М.М., Яцкин О.Н., Блищенко Е.Ю., Назимов И.В., Иванов В.Т. Протеолитическая деградация гемоглобина в эритроцитах приводит к образованию биологически активных пептидов // Биоорганическая химия. 1998. Т. 24. № 4. C. 271–281.

8. Николайчик В.В., Моин В.М., Кирковский В.В., и др. Способ опредиления средних молекул // Лаб. дело. 1991. № 10. С. 13–18.

9. Твердислов В.А., Эль Карадаги, Герасимов Е.Е. Липопротеиды плазмы крови – модификаторы ионной проводимости исскуственных мембран // Биофизика. 1980. Т. 25. № 5. С. 841–847.

10. Ingram V. The comparision of normal human and sickle cell Hb “fingerprinting” // Biochen. Biophis. Acta. 1958. Vol. 28. N 3. P. 539–546.

11. Rubenistein D., Warsendref E. An incubation medium for the eleration of Adenosin tripfosphate and 2,3 DPG in the fresh and long preserved human erythrocytes // Сan.J.Biochem. 1975. Vol. 53. N 6. Р. 671–678.