АНАЛІЗ КРОС-КОРЕЛЯЦІЙ У ЧАСОВИХ ЗМІНАХ ФІЗИКО-ХІМІЧНИХ ПОКАЗНИКІВ РОЗВИТКУ ЗАРОДКІВ В’ЮНА

Л. Івашків, М. Градюк, Д. Санагурський

Львівський національний університет імені Івана Франка,

вул. Грушевського, 4 м. Львів 79005, Україна,

e-mail: biolog@franko.lviv.ua

Період синхронного дроблення бластомерів тварин характеризується послідовним розгортанням у часі низки процесів, а саме: виявлено часові зміни рівня та коливну динаміку електричних параметрів зародкових мембран [7, 25], а також циклічні зміни швидкості біосинтетичних процесів [18, 22], взаємозв’язки між якими досліджували за модифікуючих впливів різноманітних факторів [5, 20]. Характерно, що в цей період розвиток зародка відбувається завдяки факторам епігеномної природи, накопиченим у материнському організмі впродовж оогенезу [10, 23]. Лише на п’ятій–шостій стадії розвитку в’юна, що відповідає 6 год після запліднення за t = 21°C, із початком активації ембріонального генома відбуваються значні перебудови в клітинному циклі бластомерів: починається асинхронний поділ ядер і різко падає мітотичний індекс [12], знижується коефіцієнт електричного зв’язку [2]. Усі ці події чітко відображаються у часових змінах багатьох електричних і метаболічних параметрів зародка [1, 7, 18].

Розуміння динамічних властивостей досліджуваної системи можливе за умови використання аналітичних підходів, які були започатковані в працях [19, 21]. Перевагу мають методи дослідження, що спираються на принцип множинності, як один із основних в організації часової та інформаційної структури [17]. Сьогодні ідею пошуку єдиного осцилятора відкинуто [16, 18] й деякі автори передбачають, що внутрішньоклітинні коливання є фундаментальною властивістю клітин [6].

Для глибшого дослідження взаємовідношень динамічної поведінки перебігу метаболічних та біоелектричних процесів у ранньому розвитку в’юна в цій праці вибрано кількісну оцінку його фізико-хімічних показників методом крос-кореляції часових рядів відповідних змінних. Це дає змогу виявити причинно-наслідковий характер взаємозв’язків, що саме й було поставлено за мету.

Завдання дослідження полягало в комплексному вивченні багатовимірного випадкового процесу. Статистичними об'єктами тут є часові ряди, значення змінних у яких послідовно впорядковані в часі. Множина значень кожного ряду x(t₁), …, x(t_n) потрактована як сукупність спостережень над деяким багатовимірним комплексом. Вибір моменту часу спостережень є під увагою, тобто всі часові ряди об'єднані між собою спільною часовою основою, мають однаковий інтервал між сусідніми вимірами, які позначено символами x₁, x₂, …, x_n тощо. Чіткість оцінки в цьому випадку залежить здебільшого не від кількості спостережень (n), а від внутрішньої структури ряду. Часові ряди аналізували попарно з використанням методу крос-кореляції (взаємокореляції), який можна описати так:

якщо x (t) = [x(t₁), …, x_j(t)] – багатовимірний випадковий процес, то його кореляційну функцію називають матрично визначеною:

(1)

де взаємокореляційна функція двох змінних { x_i(t), x_j (t)} – це функція арґументів t,s Î T, яку визначають із рівняння

. (2)

Крос-кореляція кількісно оцінює взаємну залежність спостережень, зсунутих на s одиниць часу. Отже, вона дає змогу дослідити зв'язок між часовими рядами, коли один із них випереджує або відстає від іншого.

У результаті розрахунків із використанням пакета програм STATGRAFICS для кожної пари значень часових рядів одержано набір коефіцієнтів крос-кореляції – крос-корелограма. За одержаними достовірними значеннями коефіцієнтів крос-кореляції парних часових рядів аналіз виконують так:

а) за значенням та знаком коефіцієнта крос-кореляції оцінюють тісність та напрям зв’язку;

б) врахування запізнення s дає змогу з’ясувати причинно-наслідковий характер взаємозв’язків;

в) кореляційні зв’язки кожного показника з цілісною системою дають змогу виявити найсуттєвіші параметри системи.

До уваги брали початковий період синхронного дроблення бластомерів зародків в’юна з моменту часу від 1,5 до 6 год розвитку. Вихідними об’єктами для вивчення вибрано часові ряди значень у цей період таких параметрів зародка: трансмембранний потенціал (ТМП) [7], швидкість поглинання кисню (ШПК) [7], швидкість гліколізу (шг) [15], рівень pH (pH) [7], коефіцієнт електричного зв’язку (КЗ) [2], активність Na⁺/K⁺-ATP-ази (АП) [1], активність казеїнкінази-2 (АК) [11]. Для всіх часових рядів інтервал між двома сусідніми значеннями спостережень становить 30 хв, що приблизно дорівнює тривалості клітинного циклу в період синхронного дроблення бластомерів в’юна за t = 21°С.

Після групування часових рядів змінних у матрицю виконано аналіз і одержано 21 крос-корелограму, які наведені в таблиці. Крос-корелограма кожної пари змінних складається з сукупності визначених за різних запізнень s коефіцієнтів крос-кореляції (R_ij(s)). Їх достовірність оцінена за таблицею граничних значень коефіцієнтів кореляції, які гарантують певний рівень значимості залежно від обсягу сукупності n [19], що відображено в таблиці за допомогою символів * та ** для достовірності 0,95 і 0,99, відповідно. Отже, як видно з таблиці, за отриманими крос-корелограмами можна з’ясувати наявність кореляційного зв’язку лише в 12-ти випадках між певними парами часових рядів.

За одержаними достовірними значеннями коефіцієнтів крос-кореляції можна констатувати, між якими часовими рядами існує взаємозв’язок, які його ступінь та напрям. Наприклад, при крос-кореляційному аналізі пар часових рядів, у яких одним із компонентів є pH, для усіх запізнень одержані недостовірні значення коефіцієнтів крос-кореляції. Це свідчить про те, що часові зміни рівня pH у період синхронних дроблень відбуваються незалежно від інших досліджуваних параметрів.

Часові ряди ТМП, ШГ і АК пов’язані тісними зв’язками з п’ятьма іншими часовими рядами. А часові ряди таких змінних, як ШПК, АП та КЗ, мають кожен по три сильних зв’язки лише з наведеними вище показниками.

Отже, кількісна оцінка взаємозалежностей між параметрами досліджуваної біосистеми дає змогу виділити з поміж усіх такі найвагоміші параметри, як ТМП, ШГ та АК, що засвідчує тісну спряженість перебігу біоелектричних та метаболічних процесів у період початкового ембріогенезу.

Характерно те, що одержано негативні значення коефіцієнтів крос-кореляції між часовим рядом КЗ та рядами: ТМП, ШГ і АП. В усіх інших випадках крос-кореляційний аналіз має позитивні значення коефіцієнтів кореляції. Отже, часове зниження коефіцієнта електричного зв’язку супроводжується зростанням у часі абсолютних значень ТМП, швидкості гліколізу та активності казеїнкінази-2. Відомо, що ступінь електричного зв’язку корелює з синхронністю дроблень зародка [7]. Наявність сильної кореляції між КЗ та названими вище параметрами свідчить про їхню тісну залежність у період синхронного дроблення від комунікаційних зв’язків між клітинами зародка, від активності транспортних систем, зокрема, від активного формування у цей період щілинних контактів, завдяки яким відбувається вільний обмін іонами та молекулами масою не більше 1000 Да [3].

Крос-корелограми парних часових рядів

R \ ^S	-5	-4	-3	-2	-1	0	1	2	3	4	5
R12	-0.22	-0.33	-0.38	-0.30	-0.10	0.23	0.72*	0.75*	0.65	0.47	0.12
R13		-0.36	-.033	-0.10	-0.31	0.80*	0.69	0.54	0.28	-0.10
R14			-0.31	-.024	0.09	0.46	0.57	0.73	0.03
R15		0.36	0.25	0.01	0.37	-0.79*	-0.83*	-0.70	-0.42	-0.03
R16	-0.32	-0.14	-0.11	0.41	0.71*	0.90**	0.43	0.22	0.01	0.15	-0.27
R17		-0.36	-0.21	0.09	0.46	0.86*	0.74	0.56	0.32	0.03
R23		-0.17	0.16	0.47	0.70	0.92**	0.45	0.06	-0.22	0.35
R24			-0.29	0.13	0.57	0.58	0.24	0.14	0.14
R25		0.02	-0.14	-0.45	-0.68	-0.56	-0.15	0.20	0.41	0.42
R26	0.28	0.44	0.48	0.55	0.59	-0.09	-0.11	-0.25	-0.26	-0.24	-0.17
R27		0.03	0.28	0.49	0.71	0.91**	0.47	0.10	-0.16	-0.30
R34			-0.34	-0.13	0.27	0.59	0.51	0.55	-0.51
R35			0.26	-0.13	-0.55	-0.97**	-0.66	-0.26	0.10
R36		-0.08	0.18	0.51	0.78**	0.73	0.22	-0.07	-0.28	-0.36
R37		-0.25	-0.04	0.27	0.63	0.99**	0.61	0.26	-0.02	-0.25
R45			0.20	-0.20	-0.46	-0.75	-0.44	-0.12	0.43
R46			0.05	0.69	0.54	0.41	0.16	-0.18	-0.29
R47			-0.03	0.57	0.52	0.56	0.24	-0.12	-0.32
R56		-0.21	-0.45	-0.56	-0.63	-0.64	-0.22	0.03	0.22	0.28
R57		0.20	-0.10	-0.41	-0.69	-0.94**	-0.56	-0.17	0.20	0.34
R67				0.02	-0.31	-0.18	0.81*	0.54	0.25	0.03

R_ij – коефіцієнт крос-кореляції, визначений при різноманітних запізненнях – s;

часові ряди змінних показників зародка:1 – ТМП, 2 – ШПК, 3 – ШГ, 4 – pH, 5 – КЗ, 6 – АП, 7 – АК.

Одержані крос-корелограми, у яких максимальне значення коефіцієнта крос-кореляції припадає на нульове запізнення s = 0, а для всіх інших запізнень значення коефіцієнтів недостовірні або дорівнюють нулю, свідчать про те, що в цих парах часових рядів скорельовані лише одночасові значення. Отже, відображені цими параметрами процеси відбуваються синхронно. Як видно з таблиці, це простежується в дев’яти випадках між ТМП – ШК, АК, АП; ШГ – АК, КЗ, ШПК; АК – КЗ, ШПК, АП.

Наприклад, часовий ряд ШПК сильно корелює з такими часовими рядами, як ТМП, ШГ, АК. Достовірний і сильний (0,92) зв’язок ШПК та ШГ підтверджує думку про те, що на ранніх стадіях розвитку глікоген є субстратом дихання [15]. Можливо, що тут бере участь казеїнкіназа-2 – фермент, що регулює різні внутрішньоклітинні процеси: фосфорилювання ферментів обміну глікогену, ліпідів, факторів білкового синтезу [11], і тому зв’язок її активності з ШПК також сильний (0,91). Крім того, встановлено дуже тісну залежність (0,99) між активністю казеїнкінази та швидкістю гліколізу.

Ситуації, в яких достовірні значення коефіцієнтів крос-кореляції припадають на s ¹ 0 засвідчують, що ці два часові ряди причинно пов’язані. Значення зсуву та його знак відображають, які змінні є випереджувальними та час їх випередження. Отже, за проведеним крос-кореляційним аналізом часових рядів виявлено існування причинно-наслідкових взаємозв’язків між такими змінними: ТМП – ШПК, ТМП – КЗ, ШГ – АП, а також ТМП – АП та АП – АК.

Зв’язок між ТМП та ШПК характеризується тим, що змінна ШПК випереджає на 1 год змінну ТМП, змінна ШГ випереджає на 30 хв змінну АП, а КЗ – на 30 хв змінну ТМП. В іншому випадку, хоча максимальні значення коефіцієнтів крос-кореляції між такими парами ТМП – АП та АК – АП припадають на нульовий зсув, достовірні зв’язки існують і при s ¹ 0. Як видно з таблиці, змінна ТМП випереджає на 30 хв змінну АП, а змінна АК – змінну АП.

Збільшення ШПК випереджає зростання абсолютних значень ТМП на одну годину. Цей зв’язок сильний (0,75) і свідчить про те, що 55% (R_ij(s))² змін у процесах генерування ТМП зародкових клітин у певний період зумовлені тими ж процесами, що за годину часу спричиняють збільшення ШПК.

Зниження КЗ випереджає на 30 хв зростання абсолютних значень ТМП за тісної залежності між цими показниками (–0,83; 69%). Ймовірно, що в основі цього зв’язку лежать процеси формування щілинних контактів. Виявлено чітко виражену часово-просторову залежність експресії генів конексонів (структурна одиниця щілинних контактів) під час розвитку зародків, якою обумовлений регулювальний вплив на розвиток [3]. Зокрема, недавно виявлено на ооцитах X.laevis, що за існування залежності провідності щілинних контактів від мембранного потенціалу та контактної поляризації між клітинами відповідають різні домени конексона С×43 [23].

Важливо зазначити, що часовий ряд АП має три тісні зв’язки з такими рядами, як ШГ, ТМП, АК, усі вони є причинно обумовленими. Це виділяє параметр Na⁺/K⁺-ATPазу з поміж усіх, як один із найсуттєвіших у досліджуваній біосистемі, можливо, й в регуляторному плані.

Один із компонентів системи, що генерує зміни ТМП завдяки підтримці онних градієнтів на мембрані – Na⁺/K⁺-ATP-аза, звідси зрозуміле високе значення коефіцієнтові кореляції між цими показниками. Максимальне значення його (0,90) припадає на нульове запізнення. Отже, зміни цих показників під час дроблення відбуваються синхронно. Але існування достовірного коефіцієнта кореляції (0,71) при s = –1 свідчить про те, що 50% змін активності помпи залежать від процесів, що відбувались на 30 хв раніше в генерації змін ТМП. Це можна пояснити циклічністю змін ТМП та АП, оскільки в кожному клітинному циклі відбувається деполяризація мембрани та гіперполяризація, що припадає на інтерфазу мітотичного циклу. Експериментально з’ясовано збільшення активності помпи під час інтерфази й передбачено її внесок у гіперполяризацію зародкової мембрани [8]. Також це може свідчити про потенціалозалежність натрієвої помпи, яка показана для ооцитів X. laevis [1].

Те, що процеси, які зумовлюють збільшення швидкості гліколізу випереджають на 30 хв зростання активності помпи та тісно спряжені між собою (0,78), засвідчує можливість регулюючої ролі гліколітичних процесів у її активності. Ймовірно, що ферменти гліколізу та Na⁺/K⁺-ATPаза пов’язані через компартменталізований пул АТP за участю білків цитоскелету, як описано для диференційованих клітин [13]. Також, можливо, існує періодична регуляція активності помпи через кінцевий продукт гліколізу – лактат, що зумовлює підсилення обміну H⁺/Na⁺ і тим самим активує помпу.

Зростання АК випереджає на 30 хв зростання АП. І хоча сильна кореляція зафіксована при s = 0 (0,82), такою ж сильною вона є і при s = 1 (0,81). Отже, без сумніву, існує регулювальний вплив між процесами, що лежать в основі активації казеїнкінази та пізніше впливають на процеси, які ведуть до активації роботи Na⁺/K⁺-ATPази. Ймовірно, що цей зв’язок реалізується також через функціонування цитоскелету. Оскільки описано, що казеїнкіназа-2 є суттєвим фактором модифікації білків цитоскелету в дозріваючих ооцитах X.laevis [19]. Враховуючи те, що зміни АП спричинені певними процесами, які лежать у основі змін ШГ та ТМП і, навпаки, процеси, що змінюють активність помпи, є причиною змін АК, можна передбачити, що саме через такий параметр, як активність Na⁺/K⁺-ATPази налагоджується функціональний взаємозв’язок між електричними та метаболічними процесами, які протікають у зародку в’юна протягом періоду синхронних дроблень бластомерів.

Як висновок з проведеного комплексного вивчення кількісної оцінки взаємозалежностей між досліджуваними фізико-хімічними показниками розвитку зародка, побудовані схеми, що враховують достовірні тісні зв’язки (рис. А) та причинно-наслідкові (рис. B).

Схеми взаємозалежностей між досліджуваними показниками: А – усі виявлені взаємозв’язки; В – виявлені причинно-наслідкові

Стрілка має напрям від параметра, який вважають причиною, до наслідкового параметра. Як видно з наведених схем, з-поміж 12-ти достовірних тісних парних взаємозв’язків виділено п’ять причинно-наслідкових, а саме: між такими параметрами: ШПК – ТМП, ШГ – АП, КЗ – ТМП, ТМП – АП, АП – АК. Крім того, на основі проведеного аналізу взаємокореляцій між усіма параметрами системи виявлено серед них найсуттєвіші: ТМП, АП, АК, ШГ.

Додаткові дослідження в цьому напрямі дадуть змогу побудувати модель, що лежить в основі досліджуваних процесів, системне вивчення яких допоможе глибше зрозуміти їхню суть.

Автори вдячні Р.Я. Гумецькому за критичні зауваження.

____________________

1. Бериташвили Д.Р., Кутателадзе Т.В., Маршани Д.О., Кафиани К.А. Аденозинтифосфат в эмбриональном развитии вьюна //Онтогенез. 1974. Т. 5. №4. С. 363–371.

2. Божкова В.П., Ковалев С.А., Чайлахян Л.М., Шилянская Э.Н. Исследование электрической связи между клетками зародышей вьюна на ранних стадиях развития // Онтогенез. 1971. Т. 2. №5. с. 512–516.

3. Божкова В.П., Розанова Н.В. Современное состояние проблемы щелевых контактов и представление об их роли в развитии //Онтогенез. 1998. Т. 29. №1. с. 5–20.

4. Болдырев А.А. Строение и функции биологических мембран. М., 1987.

5. Брежестовский П.Д., Чабан В.В., Медына И.Р., Гойда Е.А. Роль цитоскелета в регуляции электрических параметров мембран зародышей вьюна // Онтогенез. 1993. Т. 24. №3. с. 83–87.

6. Бродский В.Я. Околочасовые (ультрадианные) клеточные ритмы: начало исследований. Некоторые итоги //Онтогенез. 2000. Т. 31. №6. С. 316–329.

7. Гойда Е.А. Биофизические аспекты раннего онтогенеза животных. К., 1993.

8. Гойда Е.А., Медына И.Р., Санагурский Д.И., Стельмах Н.С. Характеристики электрофизиологических параметров мембран эмбриональных клеток вьюна при ингибировании Na⁺/K⁺-ATPазы //Онтогенез. 1989. Т. 20. №2. с. 164–170.

9. Деркач М.П., Гумецький Р.Я., Чабан М.Е. Курс варіаційної статистики. К., 1977.

10. Евсиков А.В. Механизмы регуляции раннего эмбриогенеза мыши //Онтогенез. 2000. Т. 31. №3. С.178–191.

11. Земсков Е.А., Абрамова Е.Б., Клячко О.С., Озернюк Н.Д., Михайлов В.С. Казеинкиназная активность в раннем развитии вьюна // Изв. АН Сер. биол. 1998. №2. С. 230–234.

12. Игнатьева Г.М. Ранний эмбриогенез рыб и амфибий. М., 1979.

13. Казённов А.М., Маслова М.Н. Влияние мембранного скелета безъядерных эритроцитов на свойства Na⁺/K⁺-ATPазы и Ca²⁺-ATPазы // Цитология. 1991. Т. 33. №11. С. 932–933.

14. Кендэл М.Дж., Стьюарт А. Многомерный статистический анализ и временные ряды. М., 1976.

15. Мильман Л.С., Юровицкий Ю.Г. Механизмы энзиматической регуляции углеводного обмена в раннем эмбриогенезе. М., 1973.

16. Пытьева Н.Ф., Голиченков В.А., Гусев М.В. Самоорганизация биологического развития с точки зрения теории перколяции. Обоснование дискретной, вероятностной модели процессов детерминации эмбриональных структур // Весн. Моск. ун-та. Сер.16. Биология. 1999. №4. С. 21–29.

17. Романов Ю.А. Временная организация и информация в биологических системах // Авиакосмич. экол. мед. 1995. Т. 29. №4. с. 4–9.

18. Ротт Н.Н. Ритмические процессы в раннем эмбриогенезе приуроченные к клеточным делениям // Онтогенез. 1984. Т. 15. №1. с. 5–20.

19. Рябова Л.В., Елизаров С.М., Васецкий С.Г. Эффекты экзогенной актинсвязывающей казеиновой киназы инъецированной в ооциты и яйца шпорцевой лягушки // Онтогенез. 2000. Т. 31. №1. С. 14–20.

20. Санагурский Д.И., Гойда Е.А. Описание биологических структур с позиций их организации // Пробл. Бионики. 1980. Вып. 24. С. 100–105.

21. Санагурский Д.И., Гойда Е.А., Стельмах Н.С., Кусень С.И. Влияние адреналина на динамику ТМП развивающихся зародышей вьюна // Биофизика. 1982. Т. 27. №2. с. 252–275.

22. Goida Ye.A., Oshchapovskii V.V. and Sanagurskii D.I. A nev approach to the evaluation of the relationship of different parameters influencing the dynamics of the transmembrane potential in developing loach embryos // Biophysics. 1996. Vol. 41. N2. P. 386–389.

23. Mano Y. Regulation system of protein synthesis in early embryogenesis in the sea urchin // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1968. Vol.33. N5. P. 877–882.

24. Paynton B.V. RNA-binding proteins in mouse oocytes and embryos: expression of genes encoding Y box, DEAD box RNA helicase, and polyA binding proteins // Developmental Genetics. 1998. Vol. 23. N4. P. 285–298.

25. Revilla A., Bennet M.V., Bario L.C. Molecular determinants of membrane potential dependence in vertebrate gap junction channels // Proc. Natl. Acad. Sci. 2000. Vol. 97. N26. P.14760–14765.

26. Woodward D.J. Electrophysiological correlates of cell division in frog eggs // Physiologist. 1965. Vol.8. N2. P. 308–314.