ВПЛИВ ДЕЯКИХ АМІНОКИСЛОТ ТА ЇХ ПОПЕРЕДНИКІВ НА РІСТ ДРІЖДЖІВ Candida pseudotropicalis ЗА УМОВ “СОЛЕВОГО СТРЕСУ”

С.Гудзь*, Р.Кузнєцова*, В.Червецова**

*Львівський національний університет імені Івана Франка,

вул. Грушевського, 4, м. Львів 79005 Україна

**Національний університет “Львівська політехніка”,

пл. Святого Юра, 3/4, м. Львів 79013 Україна

Дріжджі C.pseudotropicalis перспективні у виробництві білково-вітамінних концентратів і препаратів b-галактозидази на вторинній сировині – молочній та засоленій підсирній сироватках. Порівняно з іншими лактозозасвоюючими дріжджами родів Candida та Kluyveromyces [2] вони виявились стійкішими до засоленості середовища та можуть бути використані як модельні для вивчення впливу хлориду натрію на мікроорганізми.

Метою цієї роботи було дослідити деякі особливості фізіології та обміну речовин у дріжджів C.рseudotropicalis за умов росту в засолених NaCl середовищах.

Дріжджі C.рseudotropicalis ВКМ Y-209 культивували в синтетичному середовищі Беркгольдера [11] з додаванням дріжджового автолізату (1 г/л). Ферментацію здійснювали при 30 °С на круговій качалці (200 об/хв). Параметри росту оцінювали загальноприйнятими методами [6]. Біомасу визначали ваговим методом, активність b-галактозидази in situ за [5]. Як хромогенний субстрат використовували препарати орто-нітрофеніл-b-D-галактопіранозиду фірми “Sigma” (США). За одиницю b-галактозидазної активності приймали таку кількість ферменту, яка утворює 1 мкмоль нітрофенолу за 1 хв. при 30°С і рН7,0. Зміну проникності мембран дріжджів оцінювали, як описано в [9]. Лактозу визначали за методом Шомоді–Нельсона [1], амонійний азот вільних амінокислот – за [17] після екстракції гарячою водою або 75%-ним етанолом при 0–4°С упродовж доби; глутамат – ферментативним методом [4], використовуючи комерційний препарат глутаматдегідрогенази фірми “Ferak Berlin” (Німеччина).

Вимірювання параметрів росту дріжджів C. рseudotropicalis у середовищах із 5% NaCl (засолене) та без нього (незасолене) показало (табл. 1), що в присутності хлориду натрію знижувалися урожай біомаси й швидкість росту, але зростав час генерації і подовжувалася лаг-фаза. Це свідчить про перебування культури мікроорганізмів у стані “солевого стресу”. В подальших дослідах засолене 5% NaCl середовище використовували для створення умов “солевого стресу”, незасолене середовище слугувало за контроль.

Таблиця 1

Ростові характеристики C.pseudotropicalis на засоленому середовищі (р < 0,001)

Параметри росту	Середовище
	Незасолене	Засолене
Лаг-фаза, год	11,0±0,3	20,0±0,5
Час генерації, год	4,4±0,1	11,1±0,3
Швидкість росту, год^-1	0,1±0,01	0,05±0,002
Вихід біомаси, г/л	3,6±0,2	2,2±0,05

У клітинах, що виросли в засоленому середовищі, виявлено підвищений вміст білка та значне зростання b-галактозидазної активності [3]. Ймовірно, це викликано збільшенням у клітинах рівня внутрішньоклітинного індуктора b-галактозидази внаслідок змін у проникності клітин і поглинанні лактози.

Ми визначили виділення клітинами в процесі росту низькомолекулярних сполук із максимумом поглинання при 260 нм. Виявилось, що УФ-поглинаючі сполуки більше нагромаджувались у засоленому середовищі – 1,48 проти 0,8 од.густини/мг сухих клітин у контролі. Втрата цих речовин, очевидно, понижує життєздатність клітин унаслідок пошкодження мембрани. Зростання кількості таких клітин, залежно від вмісту NaCl у середовищі, ми оцінили за поглинанням метиленової синьки [10]. Для цього однакові за біомасою кількості клітин із середовища росту з різними концентраціями NaCl інкубували в 0,00001% розчині барвника. Через 10 хв клітини відділяли центрифугуванням, інтенсивність забарвлення супернатанту вимірювали на спектрофотометрі при 664 нм. Як видно з даних табл. 2, поглинання барвника клітинами зростало із збільшенням концентрації NaCl у середовищі.

Таблиця 2

Поглинання метиленової синьки клітинами C.рseudotropicalis за різних умов засоленості середовища (р < 0,001; ^*р < 0,01)

Концентрація NaCl, М	Біомаса, г/л	Поглинання барвника, од.густини на 1 г клітин
0	3,6±0,06	0,35±0,01
0,25	^*3,1±0,06	^*0,44±0,01
0,75	2,3±0,06	0,60±0,01
1,25	0,73±0,03	1,77±0,03

Засвоєння лактози клітинами дослідили, використовуючи “спочиваючі” клітини. Для цього дріжджі вирощували на незасоленому та засоленому середовищах із глюкозою до ранньої стаціонарної фази. Відмиті клітини інкубували в середовищі, яке не забезпечувало росту (г/л): (NH₄)₂SO₄ – 3; KH₂PO₄ – 0,5; MgSO₄^.7H₂0 - 0,2; лактоза – 20; вода дистильована – 1 л. Через 1, 2 та 4 год інкубації відбирали проби для визначення біомаси, активності b-галактозидази та поглинання лактози із середовища. Виявилось (табл. 3), що за однаковий час інкубації клітини, що виросли в засоленому середовищі, поглинали більше лактози, яка, очевидно, забезпечувала зростання синтезу b-галактозидази.

Таблиця 3

Засвоєння лактози та індукція b-галактозидази “спочиваючими” клітинами C.рseudotropicalis

Середовище росту	Час інкубації, год	Біомаса, г/л	Засвоєння лактози, г/г клітин	Активність фермента, Е/г клітин
Незасолене	1,0	6,6	0,20±0,005	13,8±0,2
Засолене		5,9	0,32±0,006	19,5±0,3
Незасолене	2,0	6,4	0,54±0,02	16,6±0,4
Засолене		5,9	1,10±0,04	62,3±2,3
Незасолене	4,0	6,4	1,21±0,02	23,8±0,7
Засолене		6,2	2,10±0,04	105,1±0,6

За умов “солевого стресу” в клітинах дріжджів виявлено інші суттєві фізіологічні та біохімічні зміни. В них зростав синтез гліцеролу [14, 18], трегалози та глюкану [8], ліпідів [16], змінювалось співвідношення насичених і ненасичених жирних кислот [12], зростав внутрішньоклітинний пул амінокислот, зокрема збільшувався вміст глутамату, орнітину, аргініну [15].

Наші попередні дослідження [3] показали, що інгібування росту C. Рseudotropicalis при “солевому стресі” зменшується в присутності білків й амінокислотовмісних субстратів. Ми вносили в засолене середовище чисті препарати ряду амінокислот (10 мг/мл). Вони різною мірою понижували інгібуючу дію хлориду натрію (табл. 4): глутамат, глютамін, аспартат, аспарагін, гліцин і серин відновлювали ріст дріжджів до рівня контролю. Частково інгібування росту знімали екзогенні метіонін, пролін і орнітин.

Таблиця 4

Вплив амінокислот на ріст C.рseudotropicalis у засоленому середовищі

Середовище	Біомаса, г/л	Інгібування росту, %
Незасолене	3,0	0
Засолене	2,0	33,3
Засолене +аспартат	3,1	0
+аспарагін	3,6	0
+треонін	2,2	26,7
+лізин	2,3	23,4
+метіонін	2,8	7,0
+глутамат	3,3	0
+глутамін	3,4	0
+пролін	2,9	3,4
+аргінін	2,2	26,7
+гліцин	3,0	0
+серин	3,0	0
+аланін	2,1	30,0
+гістидин	2,1	30,0
+орнітин	2,7	10,0

Можна припустити, що за умов “солевого стресу” дріжджі C.рseudotropicalis зазнають певних змін у синтезі амінокислот. Не виключено надлишкове використання амінокислот у синтезі b-галактозидази в процесі індукції ферменту. Однією з причин може бути нестача попередників амінокислот, зумовлена порушеннями в обміні вуглеводів.

Вирощування дріжджів C.рseudotropicalis у засоленому середовищі з додаванням вуглецевих попередників амінокислот та сполук, причетних до їх синтезу (1 мг/мл), показало (табл.5), що інгібування росту хлоридом натрію усувалось a-кетоглутаратом, цитратом, сукцинатом, гліцерофосфатом, рибозо-5-фосфатом і глюкозо-6-фосфатом. Оксалоацетат, як попередник амінокислот аспартатної родини, був неактивним так само, як і деякі амінокислоти цієї родини (треонін, лізин).

Таблиця 5

Вплив деяких попередників амінокислот на ріст C.sрeudotropicalis у засоленому середовищі

Середовище	Біомаса, г/л	Інгібування росту,%
Незасолене	3,60	0
Засолене	2,14	40,6
Засолене+a-кетоглутарат	3,64	0
+оксалоацетат	2,16	40,0
+фумарат	3,80	0
+цитрат	3,75	0
+сукцинат	3,60	0
+гліцерофосфат	3,74	0
+рибозо-5-фосфат	3,70	0
+глюкозо-6-фосфат	3.86	0
+фруктозо-1,6-дифосфат	2,33	7,4

В адаптації мікроорганізмів до засоленості середовищ NaCl значна роль належить глютаміновій кислоті та її похідним [13, 19]. Зокрема в клітинах Escherichia coli за умов “солевого стресу” нагромаджуються глутамат, глютамін і g-глутаміл-пептиди [13].

Ми дослідили вміст глутамінової кислоти у внутрішньоклітинному пулі амінокислот дріжджів C.рseudotropicalis, що виросли на засоленому та незасоленому середовищах (табл. 6).

Таблиця 6

Вміст амінного азоту вільних амінокислот і глутамату в клітинах C.рseudotropicalis, що виросли на засоленому середовищі (р < 0,001)

Середовище	Амінний азот вільних амінокислот, мг/г клітин	Глутамат, мг/г клітин
Незасолене	1,1±0,03	0,44±0,02
Засолене	2,6±0,09	0,26±0,01

___________________

1. Захарова И.Л., Косенко Л.В. Методы изучения микробных полисахаридов. К., 1982.

2. Кузнецова Р.А., Гудзь С.П. Утилизация подсырной сыворотки лактозоусваивающими дрожжами // Республиканская конф. “Биотехнология получения кормового белка, экологически чистых препаратов, повышающих урожайность, премиксов, ферментов и витаминов кормового назначения Днепропетровск, 23–25 окт., 1990: Тез. докл. Днепропетровск, 1990. С. 10.

3. Кузнецова Р.О., Гудзь С.П. Вплив хлоридів на ріст дріжджів і активність в них b-галактозидази // Всеукр. конф. з фізіології і біохімії тварин, Львів, 24–25 січня, 1995: Тези допов. Львів. 1994. С. 82.

4. Методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен) // Под ред. проф. М.Н.Прохоровой. Л., 1982.

5. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. М., 1976.

6. Перт С.Дж. Условия культивирования микроорганизмов и клеток. М., 1978.

7. Писарницкий А.Ф., Титова М.А. Одинцова Е.Н. и др. Сравнительное изучение осмотолерантных дрожжей к продуцированию глицерина // Прикл. биохимия и микробиол. 1989. Т. 25. Вып. 1. С. 72–76.

8. Фуряева А.В., Саубенова М.Г., Пузыревская О.М. и др. Влияние ингибирующих концентраций хлористого натрия на рост Candida tropicalis в условиях непрерывного рН-статного культивирования // Микробиология. 1985. Т. 54. Вып. 6. С. 893–898.

9. Щетинина В.Н., Беланов Е.Ф., Старобинец З.Г. и др. Влияние декаметоксина на целостность цитоплазматической мембраны грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов // Микробиол. журн. 1990. Т. 52. № 3. С. 24–28.

10. Bonora A., Mares D. A simple colorimetric method for detecting cell viability in cultures of eukaryotic microorganisms // Curr. Microbiol. 1987. Vol.7. N4. P. 217–222.

11. Burkcholder P. Influence of some environmental factors upon the production of riboflavin by yeasts // Arch.Biochem. 1943. Vol. 1. N1. P. 121–130.

12. Kunіaki H. Effect of salt stress on lipid composition and membrane fluidity of the salttolarant yeast Zygosaccharomyces rouxii // J.Gen.Microbiol. 1992. Vol. 138. N1. P. 91–96.

13. Laggan D., Logan T.M., Lynn D.G. et al. Involvement of g-glutamine peptides in osmoadaptation of Escherichia coli // J.Bacteriol. 1990. Vol. 172. N7. P. 3631–3636.

14. Larsson C., Gustafsson L. Glicerol production in relation to the ATP pool and heat production rate of the Debaryomyces hansenii and Saccharomyces cerevisiae during salt stress // Arch. Microbiol. 1987. Vol. 147. N4. P. 358–363.

15. Malaney G.W., Tanner R. The effect of sodium chloride on the urea cycle amino acid within bakers yeast (Saccharomyces cerevisiae) during aerated fermentation of glucose // Biotechnol. and Appl.Biochem. 1988. Vol. 10. N1. P. 42–48.

16. Malik N.N., Freitas Y.M. The effect of sodium chloride on single cell oil production by yeasts from marine sources // Indian J. Microbiol. 1991. Vol. 31. N1. P. 101–103.

17. Müting D., Kaiser E. Zur quantitativen Bestimmung von a-Amino-Stickstoff in biologichen Material mittels der Ninhydrin-Reaktion // Hoppe Seyler`s Z.physiol.Chem. 1963. Vol. 332. N1–6. S. 276–281.

18. Reed R.H., Chudek G.A., Foster R. et al. Osmotic significance of glycerol accumulation in exponentially growing yeasts // Appl. and Environ. Microbiol. 1987. Vol. 53. N9. P. 2119–2123.

19. Smith L.T., Smith G.M. An osmoregulated dipeptide in stressed Rhizobium meliloti // J.Bacteriol. 1989. Vol. 171. N5. P. 4714–4717.