СИНТЕЗ ЕТАНОЛУ РЕКОМБІНАНТНИМ ШТАМОМ Saccharomyces cerevisiae НА ЛАКТОЗОВМІСНИХ СЕРЕДОВИЩАХ
С. Гудзь, С. Гнатуш, О. Подопригора, І. Клим
Львівський національний університет імені Івана Франка,
вул. Грушевського, 4, м. Львів 79005 Україна,
e-mail: biolog@franco.Lviv.ua
Молочна сироватка містить до 5% лактози й може використовуватися як середовище для вирощування лактозозасвоюючих мікроорганізмів із метою одержання харчової і кормової біомаси. Спроби використати лактозу молочної сироватки включали її ферментацію штамами Kluyveromyces fragilis, Torulopsis candida, Candida humicola [3, 4] та іншими лактозозасвоюючими дріжджами. Пекарські дріжджі Saccharomyces cerevisiae безпосередньо не можуть зброджувати лактозу через відсутність у них b-галактозидази. Якщо ж лактозу гідролізувати хіміко-ферментативним шляхом, то можна отримати значну біомасу цих дріжджів [3].
Видається перспективною утилізація молочної сироватки шляхом використання створених генноінженерними методами штамів S.cerevisiae, які могли б засвоювати лактозу.
На кафедрі мікробіології Львівського національного університету створений рекомбінантний штам пекарських дріжджів S. cerevisiae SС-ІІ, що містить клоновані гени утилізації лактози дріжджів Candida pseudotropicalis.
Для вивчення здатності цього штаму утворювати етанол клітини вирощували на молочній сироватці в колбах Ерленмейєра об’ємом 500 мл, що містили 100 мл поживного середовища при 30°С за різних умов аерації. Кількість етанолу визначали алкогольоксидазним методом за допомогою аналітичного набору "Алкотест", що розроблений в Інституті біології клітини НАН України [1]. Біомасу дріжджів визначали турбідиметрично (λ = 600 нм, кювета 5 мм).
Нагромадження біомаси рекомбінантним штамом пекарських дріжджів S.cerevisiae SС–ІІ на молочній сироватці (МС) та молочній сироватці з додаванням дріжджового екстракту (2 г/л) – (YE), (NH4)2SO4 ( 3 г/л), MgSO4, (0,5 г/л) КН2Р04 (0,5 г/л) при аерації та без неї показано в табл. 1, 2.
Таблиця 1
Нагромадження біомаси рекомбінантним штамом пекарських дріжджів S.cerevisiae SC–ІІ за умов аерації
| Біомаса, г/л | ||||||||||||||
| Час культивування, год | ||||||||||||||
| Склад середовища | 16 | 18 | 20 | 22 | 24 | 48 | ||||||||
МС | 1,57±0,2 | 1,67±0,3 | 2,12±0,5 | 2,52±0,4 | 2,75±0,3 | 2,75±0,2 |
| ||||||||
МС+YE | 2,20±0,3 | 3,62±0,2 | 5,02±0,6 | 5,80±0,9 | 6,52±0,5 | 7,05±0,4 |
| ||||||||
МС+(NH4)2SO4 | 1,95±0,6 | 3,04±0,1 | 4,22±0,4 | 4,50±0,2 | 5,50±0,8 | 7,25±0,3 |
| ||||||||
МС+MgSO4 | 1,80±0,1 | 1,90±0,2 | 2,25±0,1 | 1,50±0,3 | 2,75±0,1 | 2,85±0,1 |
| ||||||||
МС+КН2Р04 | 1,87±0,3 | 2,30±0,2 | 2,87±0,1 | 3,30±0,2 | 4,25±0,1 | 4,75±0,1 |
| ||||||||
МС+(NH4)2SO4++MgSO4+ + КН2Р04 | 2,10±0,1 | 3,05±0,5 | 4,25±0,3 | 4,50±0,2 | 5,50±0,5 | 6,05±0,6 |
| ||||||||
МС+YE+ +(NH4)2SO4 + +MgSO4 + + КН2Р04 | 2,25±0,5 | 3,32±0,3 | 4,92±0,9 | 5,6±0,4 | 5,75±0,4 | 6,52±0,3 |
| ||||||||
Дріжджі культивували протягом 48 год за умов аерації і без неї. Як видно з результатів, представлених у табл.1 і 2, для S.cerevisiae SС–ІІ молочна сироватка є придатним середовищем для культивування. Однак, для одержання максимальної біомаси в середовище потрібно вносити додаткові кількості азоту у вигляді солей амонію.
Внесення солей калію чи магнію суттєво не впливало на ріст культури. При аерації клітин біомаса була в 4–5 разів більшою, ніж при культивуванні без перемішування.
З метою вивчення можливості використання отриманого штаму для трансформації лактози в етиловий спирт досліджували утворення етанолу клітинами при рості на середовищі, де єдиним джерелом вуглецю є лактоза. Визначення етилового спирту при рості на молочній сироватці та на молочній сироватці з додаванням різних компонентів проводили через 24 і 48 год культивування (табл. 2). З даних таблиці видно, що клітини досліджуваного штаму ефективно перетворювали лактозу середовища в етиловий спирт, нагромаджуючи при цьому на 48 год росту 6,85 г/л етанолу – на молочній сироватці, 7,40 г/л – на сироватці з додаванням дріжджового екстракту та 7,92 г/л – з додаванням сульфату амонію. Іони магнію і калію не стимулювали процеси зброджування лактози S.cerevisiae SС–ІІ.
Таблиця 2
Нагромадження біомаси та етанолу рекомбінантним штамом пекарських дріжджів S.cerevisiae SС –ІІ без додаткової аерації
| Склад середовища | Біомаса, г/л | Етанол, г/л |
| ||||
| Час культивування, год |
| ||||||
| 24 | 48 | 24 | 48 | ||||
МС 0,30±0,02 0,47±0,04 1,50± 0,03 6,85±0,02 МС+YE 1,45±0,06 1,67±0,03 1.85±0,05 7,40±0,04 МС+(NH4)2SO4 1,22±0,02 1,87±0,02 1,94±0,04 7,92±0,03 МС+MgSO4 0,32±0,03 0,65±0,04 1,75±0,01 6,85±0,01 МС+КН2РO4 0,31±0,02 0,68±0,01 1,25±0,01 6,75±0,01 |
| |||||||
Відомо, що при зберіганні молочної сироватки в результаті життєдіяльності молочнокислих бактерій, що спонтанно розвиваються в ній, частина лактози перетворюється в молочну кислоту, яка виявляє інгібуючий вплив на метаболізм інших мікроорганізмів. Для нейтралізації молочної кислоти в середовище вносили карбонат кальцію. Щоб збільшити концентрацію лактози до молочної сироватки вносили додатково лактозу. Інкубацію проводили протягом 120 годин. На початку культивування у культуральне середовище вносили клітини з розрахунку 5 г/л.
Як видно з результатів табл. 3, додавання до молочної сироватки СаСОз веде до збільшення синтезу етанолу на 48 годину інкубації у три рази. Однак, збільшення концентрації лактози в присутності СаСОз суттєво не впливало на синтез етанолу. Очевидно S. cerevisiae SС-11, на відміну від C.pseudotropicalis, виявився чутливим до підвищених концентрацій лактози [2].
Таблиця 3
Вплив різних концентрацій лактози на утворення етанолу рекомбінантним штамом пекарських дріжджів S.cerevisiae SС–ІІ без додаткової аерації (початкова концентрація клітин 5 г/л)
Час, год | Склад середовища | |||||||
Без лактози | 2 % лактози | 5 % лактози | 10 % лактози | |||||
МС | МС+ +СаСО3 | МС | МС+ +СаСО3 | МС | МС+ +СаСО3 | МС | МС+ +СаСО3 | |
Етанол, г/л | ||||||||
24 1,6±0,1 4,29±0,2 3,38±0,2 8,75±0,5 3,60±0,6 9,20±0,9 0,62±0,1 5,36±0,7 48 7,2±0,5 21,1±0,8 4,16±0,2 21,1±1,1 2,94±0,3 17,8±1,2 0,85±0,1 16,4±0,9 120 11,3±0,3 22,5±0,3 20,8±0,4 24,3±0,3 24,8±0,4 25,9±0,6 18,4±0,9 19,9±0,7 | ||||||||
Меласа широко використовується для промислового одержання етилового спирту. Цікаво було з’ясувати як використовується цукор меласи рекомбінантним штамом при його додаванні до молочної сироватки (табл.4). Виявилося, що додавання до молочної сироватки, упареної в три рази, 5% меласи призводить до зростання біомаси й не виявляє помітного впливу на процеси синтезу етанолу.
Завдяки мікробній переробці молочної сироватки можна одержати цінні мікробні метаболіти, які не потребують доочистки, оскільки для їх одержання використовують харчову сировину та запобігають забрудненню довкілля. Велика група лактозозасвоюючих дріжджів, незважаючи на ріст на молочній сироватці, погано засвоює лактозу й не утворює етанолу. Це обумовлено дихальним типом їхнього метаболізму.
Таблиця 4
Вплив меласи на ріст і синтез етанолу рекомбінантним штамом дріжджів S.cerevisiae SС-ІІ (без додаткової аерації)
Склад середовища | Час культивування, год | ||||
24 | 48 | ||||
Біомаса, г/л | Етанол, г/л | Біомаса, г/л | Етанол, г/л | ||
МС 0,28±0,01 1,57±0,02 0,85±0,01 6,69±0,03 МС (конц.) 0,72±0,02 1,61±0,01 1,00±0,02 6,90±0,02 МС+2% меласи 0,79±0,03 1,87±0,01 1,28±0,02 7,00±0,03 МС+3% меласи 0,85±0,02 1,86±0,02 1,35±0,03 7,13±0,02 МС+5% меласи 1,00±0,02 1,89±0,02 1,46±0,03 7,12±0,03 МС(конц.)+2% меласи 1,19±0,03 2,18±0,02 1,57±0,04 8,28±0,03 МС(конц.)+3% меласи 1,29±0,02 2,26±0,01 1,67±0,01 8,39±0,04 МС(конц.)+5% меласи 1,28±0,02 2,32±0,01 1,84±0,03 8,49±0,02 | |||||
Сконструйований нами рекомбінантний штам пекарських дріжджів S.cerevisiae SС-ІІ, що містить гени b–галактозидази й галактозидпермеази, добре росте на молочній сироватці, нагромаджуючи при цьому значні кількості етилового спирту. Внесення сульфату амонію та нейтралізація молочної кислоти за допомогою СаСОз сприяли ростовим процесам і підвищували синтез етилового спирту. Додатковове внесення лактози суттєво не впливало на етанолутворення.
Отже, рекомбінантний штам S.cerevisiae SС-ІІ можна використати для ефективної переробки молочної сироватки в дріжджовий білок і етиловий спирт.
____________________
1. Гончар М.В., Корпан Я. І., Сибірний А.А. Кількісний фотометричний аналіз етанолу з використанням очищеної алкогольоксидази та мутантних клітин метилотрофних дріжджів//Укр.біохім.журн. 1991. Т. 63. №6. С. 62–67.
2. Гудзь С.П., Гірна О.В., Гнатуш С.О., Третяк О.І. Роль етанолу в регуляції b -галактозидазної активності Candida pseudotropicalis // Мікробіол. журн. 1993. Т.55. №1. С. 43–46.
3. Квасников Е.И., Нагорная С.С., Котляр А.М. и др. Дрожжи, ростущие на молочной сыворотке / /Микробиология. 1986. Т.48. №6. С. 37–39.
4. Храмцов А.Г., Павлов В.А. Переработка и использование молочной сыворотки. М., 1988.