МОРФОФУНКЦІОНАЛЬНІ ЗМІНИ КЛІТИН ДРІЖДЖІВ Candida pseudotropicalis ЗА РІЗНИХ УМОВ КУЛЬТИВУВАННЯ
С. Гудзь, С. Гнатуш, І. Русин, О. Кулачковський, О. Мороз
Львівський національний університет імені Івана Франка,
вул. Грушевського, 4, м. Львів 79005, Україна,
e-mail: biolog@franco.Lviv.ua
Дріжджі Candida pseudotropicalis відносяться до тих небагатьох представників, що здатні засвоювати лактозу. Вони характеризуються при рості на середовищах з лактозою високим рівнем індуцибельної b-галактозидази, що інтенсивно гідролізує лактозу на глюкозу і галактозу. [2]. Моносахариди не виділяються в середовище і підлягають катаболізму. Поскільки дріжджі C. pseudotropicalis є Кребтрі позитивним видом, то у них глюкоза в аеробних умовах напочатку катаболізуються до етанолу (ефект Кребтрі), який пізніше за участю ферментів ЦТК перетворюється до кінцевих продуктів [3]. Лише після трансформації глюкози до етанолу стає можливим використання іншого цукру та етанолу.
Гени, які репресовані глюкозою у Saccharomyces cerevisiae (інвертази або дихальних функцій), є лише помірно репресовані у Кluyveromyces lactis [11], С. tropicalis [17] і, можливо, у C. pseudotropicalis. Після використання цукрів з середовища дріжджі продовжують рости, використовуючи як єдине джерело вуглецю і енергії утворений етанол. У той час в клітині вже функціонують дерепресовані ферменти гліоксилатного шунта, які далі метаболізують утворений з етанолу піруват [10].
Шлях катаболізму етанолу, утвореного при утилізації лактози дріжджами С. pseudotropicalis мало досліджений. Нашим завданням було визначення активності ферментів гліоксилатного шунта і виявлення специфічних мікротілець С2-метаболізму гліоксисом у клітинах при утилізації лактози при різному забезпеченні клітин киснем. Ультраструктура клітин С. pseudotropicalis під час культивування у середовищі з лактозою не вивчалась. Електронномікроскопічні дослідження дають змогу отримати морфологічну картину деяких метаболічних процесів, які відбуваються в клітині. Так, наприклад, ферменти ЦТК і окисного фосфорилювання асоційовані з мітохондріями, a гліоксисомні ферменти з мікротільцями [5]. Дослідження активності певних ферментів, визначення концентрації лактози та етанолу, аналіз ультраструктури клітин С. pseudotropicalis у процесі утилізації лактози можуть суттєво сприяти розумінню морфофункціональних змін, що відбуваються в клітині в процесі росту на середовищі з лактозою.
У роботі було використано дріжджі С. pseudotropicalis ВКМ У-209.
Клітини вирощували на середовищі Беркгольдера. До середовища вносили мікроелементи з розрахунку 0,5 мл/л, дріжджовий екстракт – 600 мг, тіамін – 400 мкг, біотин – 5 мкг, лактозу – 20 г чи етанол – 10 мл. Аерування культури проводили на круговій качалці (200 об./хв).
Біомасу визначали турбідиметрично (l=540 нм, кювета 3 мм). Вміст лактози в середовищі визначали за методом Шомоді-Нельсона [4]. Вміст етанолу визначали алкогольоксидазним методом з використанням набору “Алкотест” [1]. Активності b-галактозидази [9], ізоцитратліази [15] визначали в безклітинних екстрактах і виражали в нмоль/хв мг білка. Концентрацію білка в безклітинних екстрактах визначали за методом Лоурі [13]. Для електронномікроскопічних досліджень клітини дріжджів двічі відмивали дистильованою водою і осаджували центрифугуванням при 3000 об./хв упродовж 10 хв. Інтактні клітини фіксували в 1,5 % розчині KMnO4 упродовж 15-20 хв при кімнатній температурі. Фіксовані клітини промивали, обезводнювали в зростаючих концентраціях етанолу, окису пропілену та переносили в епоксидну смолу Epon-812. Ультратонкі зрізи отримували на ультрамікротомі УМТП-6 і контрастували солями свинцю за Рейнольдсом [16]. Перегляд і фотографування зразків проводили на електронному трансмісійному мікроскопі ПЕМ-100 при прискорюючій напрузі 75 кV.
У мікротільцях клітин дріжджів, які ростуть на С2-сполуках (етанолі, ацетаті) або на сполуках, які розщеплюються в процесі їх утилізації до С2-сполук (алкани, жирні кислоти), є два ферменти гліоксилатного шунта – ізоцитратліаза та малатсинтаза [15]. У клітинах нетрадиційних дріжджів С. pseudotropicalis глюкоза, яка утворюється внаслідок розщеплення лактози b-галактозидазою до глюкози і галактози перетворюється до етанолу. У дріжджів S. сerevisiae після вичерпання глюкози з середовища репресовані нею гени дерепресуються, культура адаптується до окислення етанолу [10] і відбувається індукція біогенезу гліоксисом. Для дріжджів С. pseudotropicalis при рості на глюкозі чи лактозі характерний діауксичний ріст, перша фаза якого забезпечується глюкозою чи лактозою, друга – етанолом [ 2 ].
Клітини С. pseudotropicalis вирощували у середовищі з лактозою при аерації на круговій качалці та в стаціонарних умовах. Кінетику росту і виживання клітин зображено на рис. 1,А і Б, відповідно. Ріст культури виявився інтенсивнішим і на 30 годину культивування, за умови аерування на качалці (ряд 1), у 2,67 рази більший порівняно із ростом за стаціонарних умов (ряд 2). Лише близько 60% клітин залишалися живими після 48 год росту у стаціонарних умовах, на відміну від повного виживання при достатній аерації впродовж цього ж часу. За наявності кисню етанол внаслідок декількох послідовних ферментативних реакцій перетворюється до ацетил – КоА, ацетильні групи якого включаються у цикл Кребса. За умов інтенсивного дихання та ефективного функціонування дихального ланцюга, клітини при тривалому культивуванні виживають майже всі, інтенсифікуються біосинтетичні процеси, а отже, і ріст культури, як видно з рис. 1А і 1Б. За стаціонарних умов ріст дріжджів є слабким, знижується рівень виживання клітин. Цей факт можна пояснити значним обмеженням метаболізму етанолу і тому недостатнім забезпеченням клітин АТФ, який необхідний для біосинтетичних процесів, а також, можливо, нагромадженням оцтового альдегіду, проміжного продукту катаболізму етанолу, який виявляє токсичну дію на клітини.
Для дріждів C. pseudotropicalis характерна швидка індукція лактозою синтезу b-галактозидази в умовах як достатньої, так і недостатньої аерації (рис. 2). Найвищі значення активності b-галактозидази характерні для клітин, вирощених від 8 до 24 год. Після 24 год активність фермента знижується. Утилізація лактози клітинами C. pseudotropicalis завдяки її гідролізу b-галактозидазою є повною за 30 годин (рис. 3). Засвоєння лактози клітинами в умовах різного забезпечення киснем не відрізняється. Очевидно, що наявність чи відсутність кисню в середовищі суттєво не впливає на синтез і функціонування b-галактозидази, як і на ферментацію глюкози.
Унаслідок ферментації глюкози утворюється етанол (рис. 4). Ефективність конверсії лактози в етанол подано в таблиці 1. Можливо, в аеробних умовах гени дихальних функцій у C. pseudotropicalis є репресовані глюкозою не повністю, подібно як в K. lactis [7,18]. Тому ще до повного вичерпання глюкози поряд із бродінням відбувається дихання (надходження безпосередньо пірувату або етанолу через ацетил-КоА у ЦТК).
А.
Б.
Рис.1. А. Нагромадження біомаси дріжджами С. pseudotropicalis при утилізації лактози (2%) в аеробних (ряд 1) і стаціонарних умовах (ряд 2). Б. Виживання клітин дріжджів С. pseudotropicalis при утилізації лактози (2%) в аеробних (ряд 1) і стаціонарних умовах (ряд 2)
Рис.2. Активність β-галактозидази дріжджів С. pseudotropicalis у процесі росту в середовищі з лактозою (2%) в аеробних (ряд 1) і стаціонарних умовах (ряд 2)
Рис.3. Використання лактози клітинами дріжджів С. pseudotropicalis в аеробних (ряд 1) і стаціонарних умовах (ряд 2)
Рис.4. Синтез етанолу дріжджами С. pseudotropicalis при утилізаціїї лактози (2%) в аеробних (ряд 1) і стаціонарних умовах (ряд 2)
Таблиця 1
Ефективність утворення етанолу (%) клітинами C. pseudotropicalis при утилізації 2% лактози в аеробних і стаціонарних умовах
Ч а с, г о д | У м о в и к у л ь т и в у в а н н я |
Аерація Стаціонарні умови | |
0,5 4,3 3,9 1 4,3 3,9 4 7,8 7,3 8 18,1 13,4 12 20,3 17,7 18 42,2 46,1 24 56,5 64,2 27 58,6 69,4 30 75,9 93,5 48 67,7 87,0 | |
Крім цього, в аеробних умовах після вичерпання лактози, глюкози або галактози в середовищі, клітини утилізують утворений етанол як єдине джерело вуглецю і енергії. Етанол окислюється до оцтового альдегіду НАД- залежною алкогольдегідрогеназою. Утворений ацетальдегід перетворюється альдегіддегідрогеназою до ацетату, який у ацетил-КоА-синтетазній реакції перетворюється до ацетил-КоА, ацетильні групи якого включаються в ЦТК, де вони повністю розщеплюються ферментативним шляхом з вивільненням СО2 і Н+ [5]. Клітини позбавлені здатності окислювати етанол в анаеробних умовах, оскільки через відсутність зовнішнього акцептора електронів функціонування електроннотранспортного або дихального ланцюга блоковане через неможливість регенерації основних переносчиків електронів НАДН і ФАДН2 [14]. Утворений внаслідок ферментації етанол, індукує синтез ізоцитратліази (рис. 5). В аеробних умовах етанол інтенсивно окислюється в реакціях гліоксилатного шунта, активізуються біосинтетичні процеси, тому синтез ізоцитратліази порівняно вищий в умовах аерації, ніж за стаціонарних умов (P<0,95). Це, можливо, пов’язано з вуглецевим голодуванням клітин при відсутності кисню після вичерпання глюкози і галактози.
Структура промотора гену ізоцитратліази C. tropicalis дає змогу припустити, що в цих дріжджів глюкозна катаболітна репресія його транскрипції неповна, так само як і в К. lactis [8, 11, 17] і, можливо, в C. pseudotropicalis. Тому вивчаючи кінетику синтезу ізоцитратліази у клітинах C. pseudotropicalis, вирощених у середовищі з лактозою, активність фермента виявлено вже через 0,5 год росту (рис. 5).
Рис.5. Активність ізоцитратліази дріжджів С. pseudotropicalis при рості у середовищі з лактозою (2%) в аеробних (ряд 1) і стаціонарних умовах (ряд 2)
Після вичерпання глюкози та галактози з середовища, очевидно, глюкозна репресія усувається повністю і тому спостерігається максимальна експресія гену ICL1, що кодує ізоцитратліазу, незалежно від різного доступу кисню під час культивування.
Електронномікроскопічні дослідження клітин дріжджів C. pseudotropicalis дають змогу виявити деякі відмінності у їхній ультраструктурі як при культивуванні на різних джерелах вуглецю, так і в умовах різного забезпечення киснем. Так, при утилізації етанолу в аеробних умовах в клітинах виявлено численні мітохондрії з розвиненими кристами, численні гліоксисоми, крім цього видно ядро, вакуолю, ендоплазматичний ретикулум, включення та інші менш чіткі структури (рис. 6, А). Без аерації, за умови обмеження метаболізму етанолу, у клітинах спостерігається менша кількість мітохондрій, гліоксисом, збільшена у розмірах вакуоля. Мітохондрії слабофункціонуючі, про що свідчить незначна кількість крист (рис. 6, Б).
A:
1 2 3
Б:
1 2 3
Рис.6. Ультраструктура клітин дріжджів С. pseudotropicalis при утилізаціїї етанолу (1%) в аеробних (А) і стаціонарних (Б) умовах на 12 (1), 24 (2) і 48 (3) годину росту
При культивуванні клітин C. pseudotropicalis у середовищі з лактозою в аеробних умовах у них індукується біогенез і проліферація гліоксисом, яка стає значною після вичерпання глюкози з середовища і початку утилізації етанолу як єдиного джерела вуглецю і енергії (рис. 7,А). В умовах повної дерепресії дихальних ферментів (48 год), клітини містять функціонально активні мітохондрії, подібно тим, які є при утилізації клітинами етанолу (рис. 6,А).
A:
1 2 3
Б:
1 2 3
Рис.7. Ультраструктура клітин дріжджів С. pseudotropicalis при утилізації лактози (2%) в аеробних (А) і стаціонарних (Б) умовах на 12 (1), 24 (2) і 48 (3) годину росту
Без аерації сповільнюються біосинтетичні процеси, гліоксисом мало, мітохондрії невеликі й їхня кількість їх незначна, збільшені вакуолі, видно включення в клітинах після тривалого періоду культивування (рис. 7, Б). На 48 год росту ультраструктура клітин є подібною до клітин після культивування у середовищі з етанолом при слабкій аерації (рис. 6, Б). Не дивлячись на індукцію етанолом біогенезу і проліферації мікротілець (гліоксисом) за умов недостатнього забезпечення киснем клітин, ці процеси повноцінно не відбуваються, оскільки енергозалежні [6, 12].
Таким чином, в клітинах нетрадиційних дріжджів C. pseudotropicalis при утилізації лактози на усіх фазах росту формуються і функціонують специфічні мікротільця С2 метаболізму – гліоксисоми, незалежно від забезпечення культури киснем, що є доказом неповної глюкозної катаболітної репресії їх біогенезу та синтезу ферментів дихальних функцій в присутності лактози, глюкози чи галактози. Стаціонарні умови культивування клітин є причиною обмеження утилізації утвореного з гексоз етанолу, завдяки чому спостерігається активізація деградативних процесів. Недостатнє енергетичне забезпечення клітин в умовах стресу, голодування, при слабкій аерації (етанол, утворений з лактози, як єдине джерело вуглецю і енергії) зумовлює різке сповільнення біосинтетичних процесів, зокрема біогенезу мікротілець та синтезу ізоцитратліази.
____________________
1. Гончар М.В., Корпан Я.І., Сибірний А.А. Кількісний фотометричний аналіз етанолу з використанням очищеної алкогольоксидази та мутантних клітин метилотрофних дріжджів // Укр. біохім. журн. 1991. Т.63. №6. С. 62-67.
2. Гудзь С.П., Гірна О.В., Гнатуш С.О. Деякі особливості катаболізму вуглеводів і регуляції b-галактозидазної активності у лактозозасвоюючих дріжджів // Мікробіол. журн. 1995. 57. № 3. С. 37-41.
3. Гудзь С.П., Гнатуш С.О., Закальський А.Є. Вплив умов культивування на алкогольдегідрогеназну активність C.pseudotropicalis // Мікробіол. журн. 1995. 57. № 5. С. 40-43.
4. Захарова И.Я., Косенко Л.В. Методы изучения микробных полисахаридов. Киев, 1982.
5. Квасников Е.И., Щелекова И.Ф. Дрожжи. Биология. Пути использования. Киев, 1991.
6. Bosch H., Schutgens R.B.H., Wanders R.I.A., Tager J.M. Biochemistry of peroxisomes // Annual Rev. Biochem. 1992. Т.61. P.157-97.
7. Breuning K.D. Glucose repression of LAC gene expression in yeast is mediated by the transcriptional activator LAC9// Mol. Gen. Genet. 1989. Т.216. P.422-427.
8. Gancedo J.M. Yeast carbon catabolite repression // Microbiology and Molecular Biology reviews. 1998. P.334-361.
9. Guerente L. Yeast promoters and lacZ fusion designed to study expression of cloned genes in yeast // Methods in enzymology. 1985. V.101. N2. P.181-191.
10.
11. Klaus W. Editor. Nonconventional yeast in biotechnology. A handbook // Springer Verlag
12. Klionsky D.J., Ohsumi Y. Vacuolar import of proteins and organelles from the cytoplasm // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1999. Vol.15. P.1-32.
13. Lowry O.H., Rosebrough N.Y., Farr A.L., Randall R.I. Protein determination with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. Vol.193, N2. P.265-275.
14. Prescott L.M., Harley J.P., Klein D.A. Microbial Growth and Metabolism. P. II. // Microbiology. Second ed. 1993.
15. Reeves H.C., Rabin R., Wegener W.C. and Ajl S.J. Assays of enzymes of the tricarboxylic acid and glyoxylate cycles // Methods in Microbiology. Norris J.R. and Ribbons W. Eds. New York; 1971. Vol.6. P.425-462.
16. Reynolds E.S. The use of lead citrate at high pH as an electronopaque stain in electron microscopy // J. Cell Biol. 1963. Vol.17. P.208-212.
17. Umemura K., Atomi H., Kanai T., Takeshita S.,Kanayama N., Yeda M. and Tanaka A. Derepression of gene expression mediated by the 5΄upstream region of the isocitrate liase gene of Candida tropicalis is controlled by two distinct regulatory pathways in Saccharomyces cerevisiae // Eur. J. Biochem. 1997. Vol.243. P.748-752.
18. Webster T.D., Dickson R.S. The organisation and transcription of the galactose gene cluster of Kluyveromyces lactis // Nucleic Acids Res. 1988. Vol.16. P.8011-8028.