СПІЛЬНИЙ ВПЛИВ МУТАЦІЙ red2 І red3 НА БІОСИНТЕЗ РИБОФЛАВІНУ ТА ФЕРИРЕДУКТАЗНУ АКТИВНІСТЬ У ДРІЖДЖІВ Pichia guilliermondii

К. Капустяк, М. Стенчук

Інститут біології клітини НАН України,

вул. Драгоманова, 14/16, м.Львів 79005, Україна,

e-mail: kapustyak@biochem.lviv.ua

Дріжджі Pichia guilliermondii є зручною моделлю для дослідження генетичних механізмів регуляції біосинтезу рибофлавіну (РФ) у еукаріотичних мікроорганізмів [1]. Показано, що дефіцит заліза в середовищі або пошкодження регуляторних генів негативного типу дії RIB80 [2], RIB81 [3], HIT1 [4] і RED1[5] спричиняють дерепресію майже всіх ферментів флавіногенезу та як наслідок – надсинтез РФ у вищезгаданих дріжджів. Ці ж гени контролюють також асиміляцію заліза в P.guilliermondii, запобігаючи його надмірному нагромадженню у клітинах. Очевидно, в P.guilliermondii функціонує механізм, який координує як постачання дихального ланцюга обома кофакторами – флавінами та залізом, так й інші потреби клітини в йонах заліза. Для розуміння принципу дії цього механізму потрібно ідентифікувати всі гени, що беруть участь у його функціонуванні. В цій праці наводяться докази існування двох нових генів RED2 і RED3, які теж беруть участь у регуляції зазначених вище процесів, і результати дослідження властивостей їх мутантних алелей red2 та red3 та характеру їх взаємодії при суміщенні в одному гаплоїдному геномі.

Список використаних у праці штамів та їх генотип подано в табл. 1. Склад середовищ для вирощування дріжджів, умови вирощування і методи генетичного аналізу описано раніше [6, 7]. Для ідентифікації мутантів із підвищеною редуктазною активністю використовували агаризоване середовище Беркгольдера, яке містило 40 мг/л 2, 3, 5- трифеніл-тетразолійхлориду (ТТХ) і 20 г/л глюкози [4]. При вивченні впливу міді на ріст досліджуваних штамів у середовище додавали CuSO₄·5H₂O у відповідній концентрації. Біомасу дріжджів визначали турбідиметрично на фотоелектроколориметрі ФЕК-56М (кювета 3 мм, світлофільтр № 6). Концентрацію флавінів у культуральній рідині визначали флюориметрично на апараті ЕФ-3М. Активність ГТФ-циклогідролази визначали в безклітинних екстрактах за описаною раніше методикою [8]. Фериредуктазну активність у клітинах дріжджів визначали за [5], використовуючи для зв’язування Fe²⁺ a,a`-дипіридил. Концентрацію комплексу Fe²⁺-дипіридил визначали на спектрофотометрі СФ-46 при 522 нм. Статистичне опрацювання результатів проводили з використанням програми “Microcal origin”.

Таблиця 1

Штами P. guilliermondii, використані в роботі.

Штам	Генотип*
L2	MAT ^- his-17
LV113	MAT ^+lys-1
LV163	MAT ^-rib1-86 ade2-19
LV381	MAT ^- hit1-1 his-17
LV107	MAT ^+ rib80-22 arg-1
LV158	MAT ^- rib81-131 his-17
LV455	MAT ^- red1-1 his-17
LV370	MAT ^– rib1-86 red2-1 his-17
LV413	MAT ^– rib1-86 red3-1 arg-1

* rib1-86, his, lys,ade, arg – локуси, що обумовлюють рибофлавін-, гістидин-, лізин, аденін- та аргінінзалежність, відповідно; rib80, rib81, hit1, red1, red2, red3 – мутантні алелі регуляторних генів негативного типу дії. MAT ^– і MAT ⁺ – локуси типу спарювання.

Нову колекцію мутантів із порушеною регуляцією флавіногенезу виділено нами при дослідженні генетичних механізмів супресії мутації rib1-86. Мутант rib1-86 P. guilliermondii за своїми властивостями подібний на ідентифіковані раніше мутанти rib1: по-перше, мутація rib1-86, як і rib1, локалізується у локусі RIB1, який кодує ГТФ-циклогідролазу (перший фермент біосинтезу РФ), і, по-друге, вона теж блокує активність ГТФ-циклогідролази, що обумовлює повну залежність мутанта rib1-86 від наявності в середовищі РФ у концентрації 200 мкг/мл [9]. Однак між мутантами rib1 і мутантом rib1-86 є істотна відмінність: останній ревертує до РФ-незалежності завдяки появи в його геномі супресорних позалокусних мутацій, які пошкоджують регуляторні гени флавіногенезу неґативного типу дії. Раніше при дослідженні спонтанних РФ-незалежних ревертантів мутанта rib1-86, які активно відновлювали ТТХ, виявлено новий клас регуляторних мутантів, позначених як red1 [5]. Згодом з’ясувалось, що серед ТТХ-редукуючих ревертантів rib1-86 є й інші мутанти, які комплементують усі відомі до цього часу мутації, зокрема й red1. Комплементаційний аналіз таких мутантів за ознакою “відновлення ТТХ” дав змогу виділити серед них п’ять нових груп комплементації, названих red2 – red6 (reduction) [13]. У цій праці наводяться дані про дослідження властивостей представників перших двох комплементаційних груп red2 і red3.

Як вихідні в цій праці використовували ревертанти LV370 і LV413 мутанта LV163, які, крім мутацій, що викликають прототрофність по рибофлавіну й обумовлюють підвищену редуктазну активність, містили й вихідну батьківську мутацію rib1-86. Тому їх схрещували з штамом дикого типу LV113 і в одержаних гібридів (D326 i D336, відповідно) індукували мейоз і відбирали мейотичні сегреганти, які внаслідок розщеплення втратили мутацію rib1-86, але містили мутації red2 чи red3. Для цього висівали сегреганти на агаризоване середовище із ТТХ і відбирали ті, газон яких був червоним, що свідчило про активне відновлення ТТХ. Відібрані ТТХ-редукуючі сегреганти обох диплоїдів схрещували із мутантами rib1-86. В одержаних гібридів перевіряли здатність рости на середовищі без РФ. РФ-незалежність гібрида свідчила про його гетерозиготність по rib1-86. Таким способом була виділена колекція мутантів red2 та red3 із різними комбінаціями типів спарювання і ауксотрофних маркерів, що дало змогу схрещувати їх між собою та з іншими мутантами.

Наступним етапом роботи було дослідження фенотипових проявів мутацій red2 та red3. Для цього ми вибрали по три типових представники кожного класу та досліджували їх властивості (табл. 2). З’ясувалося, що за умов нормального забезпечення залізом штами red2 та red3 нагромаджують у середовищі в середньому в 2,1 та 2,3 рази більше РФ, ніж штам дикого типу. Питома активність ГТФ-циклогідролази в них була в 2,7 та в 3,2 рази, відповідно, більша, ніж у штама дикого типу. Цікаво, що за умов дефіциту заліза в мутантів red2 та red3 рівень флавіногенезу та активність ГТФ-циклогідролази мало відрізняються від таких у штаму дикого типу. Наведені вище результати дають підставу для висновку, що обидві мутації спричиняють посилення синтезу РФ шляхом дерепресії активності ГТФ-циклогідролази й, очевидно, інших ферментів флавіногенезу. Можна припустити, що мутації red2 та red3 порушують механізм негативного контролю біосинтезу РФ у P. guilliermondii.

Відомо, що для мутантів цих дріжджів із подібними порушеннями (rib81, rib80, hit1 та red1) характерноа дерепресія активності фериредуктази, яка контролює перший етап засвоєння йонів заліза клітинами цих дріжджів – відновлення Fe³⁺ до Fe²⁺ [4, 5, 10]. Подібне фенотипове проявлення властиве й для мутацій red2 та red3 – у представників обох класів активність цього фермента в середньому в 4,3 та 3,7 рази, відповідно, більша, ніж у штама дикого типу (табл. 2).

Таблиця 2

Флавіногенез, активність ГТФ-циклогідролази й фериредуктази в клітинах штама дикого типу та регуляторних мутантів P.guilliermondii (М ± m, n = 4–6)

Генотип*	Fe в сере- довищі, мг/л	Рибофлавін, мг/г сухих клітин	Активність ГТФ-цикло- гідролази, Е/мг білка×10^-5	Швидкість відновлення Fe^3+, Нмоль Fe/мг сухих клітин/хв
RED2RED3 (1)	0,20 0,01	0,18±0,02 11,24±0,82	0,69 ± 0,08 10,52 ± 0,68	2,85 ± 0,09 4,95 ± 0,34
red2 (3)	0,20 0,01	0,37±0,06 12,01±1,15	1,85 ±0,72 11,02 ±1,39	12,22± 0,15 14,97± 0,17
red3 (3)	0,20 0,01	0,40±0,02 12,64±0,69	2,22±0,53 10,63±0,58	12,62±0,15 15,85±0,21
red2 red3 (3)	0,20 0,01	0,91±0,13 13,63±1,2	3,73±0,57 12,53±0,98	16,83±0,56 18,32±1,43

* у дужках – кількість досліджених штамів.

Оскільки за своїми фенотиповими проявами мутації red2 та red3 нагадують виділені раніше регуляторні мутації негативного типу дії rib81, rib80 ,hit1та red1, ми вважали за доцільним перевірити належність їх до нових груп комплементації. Для цього штами red2 і red3 схрестили з вищезгаданими регуляторними мутантами, а також між собою. У одержаних гібридів досліджували рівень флавіногенезу та здатність відновлювати ТТХ. Як видно з рис. 1, мутанти red2 і red3 комплементують між собою, а також із усіма іншими регуляторними мутаціями, які пошкоджують неґативний контроль біосинтезу РФ. Водночас гомозиготні диплоїди “red2 x red2” і “red3 x red3” мають достовірно вищі рівні флавіногенезу, ніж гетерозиготні.

Рис.1. Біосинтез РФ гібридами мутантів P.guilliermondii Гібриди: 1. red2xred2. 2. red3xred3. 3. red2xred3. 4. red2xwt. 5. red3xwt. 6. red2xred1. 7. red2xhit1. 8. red2xrib80. 9. red2xrib81. 10. red3xred1. 11. red3xhit1. 12. red3xrib80. 13. red3xrib81

Така ж картина спостерігається й у випадку вирощування гібридів на агаризованому середовищі з ТТХ. Гібриди “red2 x red2” і “red3 x red3” мали червоний колір, а решта були білими. Наведені дані чітко підтверджують належність мутацій red2 і red3 до нових груп комплементації, а також вказують на рецесивний характер обох цих мутацій

Відомо, що мутації hit1та red1 збільшують чутливість клітин до йонів міді [5]. Такий же ефект мають і обидві досліджувані нами мутації. На рис. 2 зображено результати вивчення впливу різних концентрацій CuSO₄ на ріст мутантів red2 і red3 порівняно зі штамом дикого типу. Видно, що вже за концентрації йонів міді 0,2 мМ у мутантів спостерігається майже повне пригнічення росту, тоді як у штаму дикого типу значне пригнічення помітно при концентрації 0,6 мМ. Незначна різниця у чутливості до йонів міді в мутантів red2 і red3 не є достовірною.

Висока редуктазна активність, яку обумовлюють мутації red, дає змогу легко ідентифікувати клони, що їх містять, за їх червоним кольором на середовищі з ТТХ. Це дало змогу виявити характер успадкування мутацій red2 і red3. Аналіз випадкових вибірок із 100 мейотичних сегрегантів диплоїдів RED2/red2 і RED3/red3 показав, що співвідношення двох класів мейотичних сегрегантів (червоний або білий колір колоній на середовищі з ТТХ) у обох досліджуваних гібридів близьке до теоретично очікуваного 1:1. Це свідчить про моногенний характер успадкування мутацій red2 та red3. Дослідження флавіногенної активності червоних і білих сегрегантів обох диплоїдів показало (рис. 3), по-перше, що сегреганти генотипу red2 та red3 (червоні) у середньому синтезують більші кількості РФ- (M = 0,37 мг/г ± 0,02 , n = 48 та M = 0,41 мг/г ± 0,02, n = 52), ніж сегреганти дикого типу – (M = 0,18 мг/г ± 0,02 , n = 52 та M = 0,21 мг/г ± 0,01, n = 48). По-друге, представлені дані демонструють, що хоча мутації red2 і red3 посилюють флавіногенез, однак кращі за продуктивністю сегреганти дикого типу переважають слабших за цією ознакою мутантних штамів, як і у випадку red1 [5]. Отже, фенотипове проявлення мутацій red2 і red3 за ознакою “біосинтез РФ” великою мірою залежить від їх генотипового оточення. Виявилось також, що за умов нормального забезпечення клітин залізом мутанти red2 і red3 ростуть дещо повільніше, ніж сегреганти дикого типу. Так, на четверту добу вирощування мутанти red2 і red3 мали біомасу, відповідно: 3,84 мг/мл ± 0,126 та 4,16 мг/лм ± 0,472 при n = 48–52, а в сегрегантів дикого типу за цих же умов біомаса була 5,48 мг/мл ± 0,217 при n = 48–52.

Рис.2. Вплив йонів міді на ріст мутантів red2, red3 і штаму дикого типу L2

Рис.3. Мінливість рівнів флавіногенезу у сегрегантів диплоїдів “red2 x дикий тип” (а), “red3 x дикий тип” (в)

Раніше показано, що суміщення в одному геномі мутацій rib81, rib80 та hit1 веде до значного посилення іх проявів. Припускають, що продукти цих генів можуть синергідно взаємодіяти між собою в процесі функціонування механізму, що постачає дихальний ланцюг двома необхідними кофакторами – флавінами й залізом [11, 12]. Гени RED2 і RED3, очевидно, також долучені до цього механізму. У зв`язку із цим ми досліджували характер взаємодії мутантних алелей red2 і red3 при об`єднанні їх у одному гаплоїдному геномі. Для цього в гібрида “red2 х red3”, описаного вище, індукували мейоз і одержували ауксотрофні мейотичні сегреганти. Наявність обох мутацій у кожного з відібраних сегрегантів визначали шляхом схрещування його з мутантами red2 та red3. Висока флавіногенна та ТТХ-редуктазна активність гібридів обох типів свідчили про наявність у геномі сегреганта мутацій red2 і red3. Отже виділено колекцію сегрегантів, генотип яких був red2 red3. Як видно із даних, поданих у табл. 2, за умов нормального постачання залізом у подвійних мутантів red2 red3 активність ГТФ-циклогідролази та рівень флавіногенезу були близькими до їх гіпотетичних рівнів, які могли б бути у випадку простого сумування ефектів обох мутацій, а за умов дефіциту заліза вони не відрізнялися суттєво від їх рівнів у батьківських штамів red2 чи red3. Рівень фериредуктазної активності в подвійних мутантів не був істотно вищим, ніж у вихідних штамів. Отже, мутації red2 та red3 взаємодіють за адитивним типом тільки в процесі біосинтезу РФ.

Одержані нами результати свідчать про існування ще двох невідомих раніше генів RED2 та RED3, які, очевидно, разом із ідентифікованими раніше генами RIB81, RIB80, HIT1 та RED1 регулюють біосинтез РФ за неґативним типом у дріжджів P.guilliermondii. Оскільки рівень біосинтезу РФ – кількісна ознака, то в такій кількості регуляторних генів немає нічого незвичайного. Більше того, одержані нами попередні результати [13] дають підставу стверджувати про існування ще декількох регуляторних генів негативного типу дії.

Цікавим є інше – всі шість перерахованих вище генів контролюють, очевидно, ще й процеси асиміляції заліза в P.guilliermondii. Хоча ми не визначали безпосередньо інтенсивність транспорту цього металу в клітинах штамів red2 та red3, виявлене нами збільшення фериредуктазної активності в цих мутантів може свідчити про посилення транспорту заліза в їх клітини, оскільки відновлення Fe³⁺ до Fe²⁺ є одним із важливих етапів асиміляції заліза дріжджовими клітинами [10].

Очевидно, виявлення всіх ланок спільного генетичного контролю за постачанням дихального ланцюга клітин P.guilliermondii рибофлавіном і залізом матиме не тільки важливе фундаментальне, але й прикладне значення, оскільки сприятиме удосконаленню методів селекції штамів – надсинтетиків РФ, які могли б служити основою промислового виробництва цього вітаміну [14].

Автори вдячні Д.В. Федорович за методичну допомогу та обговорення результатів праці.

_____________________

1. Шавловский Г.М., Логвиненко Е.М. Схверхсинтез флавинов у дрожжей. // Укр. биохим. журнал. 1985. Т. 57. № 4. С. 98–112.

2. Шавловский Г.М., Федорович Д.В., Куцяба В.И., Бабяк Л.Я. Участие гена RIB80 в регуляции биосинтеза рибофлавина и транспорта железа у дрожжей Pichia guilliermondii // Генетика. 1992. Т. 28, № 9. С. 25–32.

3. Шавловский Г.М., Федорович Д.В., Бабяк Л.Я. Влияние мутации rib81 на биосинтез рибофлавина и транспорт железа у дрожжей Pichia guilliermondii // Микробиология. 1993. Т. 62. №5. С. 897–903.

4. Протченко О.В. Дослідження фериредуктазної системи дріжджів Pichia guilliermondii // Автореф. дис. канд. біол. наук. Львів, 1997. С. 23.

5. Стенчук М.М., Капустяк К.Є. Новий ген RED 1, який контролює біосинтез рибофлавіну і активність фериредуктази у дріжджів Pichia guilliermondii // Біополімери і клітина. 1999. Т. 15. №6. С. 522–528.

6. Шавловский Г.М., Сибирный А.А., Кшановская Б.В. и др. Генетическая классификация рибофлавинзависимых мутантов дрожжей Pichia guilliermondii // Генетика. 1979. Т. 15. №9. С. 1561–1568.

7. Шавловский Г.М., Жарова В.П., Щёлокова И.Ф. и др. Флавиногенная активность природных штамов дрожжей Pichia guilliermondii // Прикл. биохимия и микробиология. 1978. Т. 14. №2. С. 184–189.

8. Шавловский Г.М., Логвиненко Е.М., Закальский А.Е. Заходыло И.В. Влияние железа, актиномицина Д и циклогексамида на синтез GTP-циклогидролазы у флавиногенных дрожжей //Биохимия. 1982. Т. 47. №1. C. 28–33.

9. Шавловский Г.М., Стенчук Н.Н., Кшановская Б.В. Влияние регуляторной мутации в локусе RIB1 на биосинтез рибофлавина у дрожжей Pichia guilliermondii // Биополимеры и клетки. 1991. T7. №6. С. 96–99.

10. Kaplan J, Askwith C.C., de Silva D. Molecular biology of iron acquisіtion in Saccharomyces cerevisiae // Molecular Microbiology. 1996. Vol. 20, N1. Р. 27–34.

11. Шавловский Г.М., Стенчук М.М., Федорович Д.В., Куцяба В.І. Про взаємодію факторів негативного контролю біосинтезу рибофлавіну у дріжджів Pichia guilliermondii // Доп. АН України. 1994. №10. С. 138–140.

12. Федорович Д.В., Романюк Т.М., Протченко О.В., Гудзь С.П. Совместное влияние мутаций rib81 и hit на биосинтез рибофлавина и транспорт железа у дрожжей Pichia guilliermondii // Микробиология . 2000. Т. 69. №2. С. 143–147.

13. Kapustiak K.E. A novel genes which control riboflavin biosynthesis and iron assimilation in Pichia guilliermondii yeast// conference on genetics and molecular biology for students and young scientists devoted to100^thanniversary of genetics (L’viv, april 2000. Absract book. L’viv. 2000. P. 42).

14. Стенчук М.М., Гусак Я.С., Федорович Д.В., Струговщикова Л.П., Бабяк Л.Я., Шах Є.С., Снітинський В.В. Біологічна цінність кормових препаратів, отриманих на основі дріжджів – продуцентів вітаміну В₂ , у раціоні курчат // Міжнар. конф. «Біологічні основи живлення с/г тварин» Львів, вересень 1998. Тези доп. Львів, 1998. С. 62–63.