РЕАКЦІЇ ТРАНСАМІНУВАННЯ У СЛИЗОВІЙ ОБОЛОНЦІ ТРАВНОГО ТРАКТУ ПЛОДА ЗА ДІЇ НАДЛИШКУ АМІАКУ В РУБЦІ КОРОВИ

І. Фоменко^*, О. Возна^*, Л. Калачнюк^**, Г. Калачнюк^*

^*Науково-дослідний інститут біотехнологічних основ підвищення

продуктивності тварин Львівської державної академії ветеринарної

медицини імені С. З. Гжицького,

вул. Пекарська, 50, Львів 79010, Україна,

^**Інститут молекулярної біології і генетики Національної академії наук України,

вул. Заболотного, 150, Київ 143, Україна,

e-mail: lilimarg@polinet.lviv.ua

Раніше ми повідомляли, що, поряд із дуже низькою активністю глутаматдегідрогенази (GDH) у слизовій оболонці шлунково-кишкового тракту (ШКТ) і печінці 6,0–8,5-місячних плодів, спостерігаються порівняно високі рівні активності трансаміназ [6, 7]. Це вказує на домінуючу роль амінотрансферазних реакцій, які ведуть до утилізації аміаку та утворення амінокислот і, передусім аспарагінової кислоти й аланіну.

У крові тільних корів суттєво змінюється рівень метаболітів, що зумовлюється змінами обміну речовин у їхньому організмі внаслідок перебудови гормонального статусу, умов годівлі, інтенсивності рубцевого метаболізму, синтезу й використання поживних речовин та їх транспорту в систему кровообігу плода. Тут особливого значення набуває вивчення механізмів знешкодження низькомолекулярних токсичних сполук, що можуть надходити ззовні чи утворюватися в результаті незбалансованого живлення, зокрема й аміаку. Метаболічні процеси, які відбуваються у слизовій травного тракту, сприяють значному видозміненню продуктів біосинтезу й транспорту їх у обидва напрямки: всмоктуванню та виділенню в порожнину каналу.

Якщо в дорослої тварини це все значною мірою з’ясовано, то в плода воно залишилося ще поза належною увагою. Але з погляду на швидкість формування всіх відділів травної системи в пренатальний період і на значення цього процесу в перші та подальші дні після народження, науково-практична зацікавленість зростає і в цьому напрямі. Адже одержана інформація може бути використана для цілеспрямованого впливу на ріст і розвиток плода з допомогою ендо- й екзогенних факторів. Тому основною метою нашої роботи було вивчення реакцій трансамінування у слизовій травного тракту плода за дії надлишку аміаку в рубці корови-матері.

В експериментах використовували тканини слизової оболонки та печінки 6–8,5-місячних плодів, одержаних від 15 корів 7–8-річного віку [6, 7]. Молочна продуктивність останніх за попередню лактацію становила 2100–2300 кг молока. Перед забоєм усі корови утримувалися на господарському раціоні, в якому основна кількість протеїну припадала на ріпаковий шрот (РШ). П’яти коровам контрольної групи (К) його згодовували по 550–750 г/гол. у день. П’яти коровам дослідної групи (Д-1) додатково згодовували сечовину з розрахунку 0,25 г/кг живої маси, а 5 коровам другої дослідної (Д-2) групи, крім цього, давали ще й цеолітовий порошок, який містив понад 80% діючої речовини (клиноптилиліту) Сокирницького родовища, виходячи з розрахунку 0,5 г/кг живої маси.

Для одержання картини загального метаболічного стану в корів-матерів відбирали кров із яремної вени та вмістиме рубця носоглотковим зондом [8].

За раніше описаними методиками [8, 9] у крові визначали концентрацію сечовини, глюкози, молочної кислоти та інші показники, а у вмістимому рубця – аміак і кінцеві продукти ферментації поживних речовин раціону.

Від плода (після забою корів-матерів) відбирали слизову рубця, сітки, книжки, сичуга, сліпої і прямої кишок і печінку. Їх промивали розчином, що містив 153,3 мМ NaCl і 5 мМ Na₂EDTA (t~4°С). Далі тканинні зразки гомогенізували в гомогенізаторі Поттера–Элвегейма в середовищі такого складу (мМ): сахароза (250,0), трилон Б (5,0) і трис-НСl-буфер (5,0) при рН = 7,4. Субклітинні фракції (мітохондріальну й цитозоль-мікросомальну) одержували на холоді методом диференційного центрифугування [6, 7]. Мiтохондрії триразово промивали в середовищі виділення і солюбілізували в 1%-ному розчині тритона Х-100.

Активність основних ензимів трансамінірування – L-аспартат: 2-оксоглутарат-амінотрансферази (AST; ЕС 2.6.1.1.) і L-аланін: 2-оксоглутарат-амінотрансферази (ALТ; ЕС 2.6.1.2.) визначали за допомогою лабораторного набору Bio-La-Tests (Lachema, Brno, Bohemia), виражаючи її у мкмолях пірувату/хв×1 г білка. Білок у пробах визначали за Lowry et al. (1951).

Одержані цифрові дані обробляли статистично й різниці вважали вірогідними при Р < 0,05.

Про загальний стан метаболічних процесів у корів-матерів можна довідатись із даних табл. 1 і 2. 

Таблиця 1

Вплив добавок сечовини (Сч) і цеоліту (Ц) на рівень утворення кінцевих продуктів ферментації в рубці корів-матерів (М ± m; n = 5)

Продукти ферментації	Групи тварин
	Контрольна (РШ)	Дослідна-1 (РШ+Сч)	Дослідна-2 (РШ+Сч+Ц)
N-NH3, мг/л	72,9±6,7	158,8±14,3^***	109,6±17,1^*
Целюлолітична активність, %	23,6±0,18	27,9±2,81^*	29,8±1,92^**
Сума ЛЖК, мМ/л	96,7±4,1	108,5±6,36	119,7±5,72^*
В т.ч.індивідуальні кислоти, моль%:
Ацетат (С2)	64,3±1,16	60,0±0,92	58,0±0,71^*
Пропіонат (С3)	21,5±0,21	23,7±0,14	26,4±0,31^*
Бутират (С4)	14,2±0,17	16,3±0,12^*	15,6±0,09
рН	6,54±0,06	6,41±0,07	6,21±0,03

* р < 0,05, ** р < 0,01, *** р < 0,001 порівняно з контролем

Таблиця 2

Концентрація метаболітів у крові корів-матерів (мг/л; М ± m; n = 5)

Метаболіти	Групи тварин
	Контрольна (РШ)	Дослідна-1 (РШ+Сч)	Дослідна-2 (РШ+Сч+Ц)
Сечовина	166±13,2	237±21,2^***	185±14,3
Глюкоза	645±12,2	501±10,1^**	552±14,3
Лактат	110,1±6,1	149,6±4,2^*	127,2±3,3
Кетонові тіла	60,2±4,1	78,8±7,3^*	65,1±3,9

Із поданих у табл. 1 і 2 даних видно, що згодовування добавок сечовини суттєво впливає на інтенсивність ферментації в рубці та концентрації метаболітів у крові корів-матерів. Статистично вірогідно зростає концентрація аміаку (більше як у двічі), целюлозолітична активність і певною мірою сума летких жирних кислот. Загалом пулі ЛЖК відмічено збільшення молярного відсотку бутирату й пропіонату за рахунок зниження вмісту ацетату. Такі зміни в рубці супроводжуються підвищенням концентрації сечовини в крові (р < 0,001), лактату (р < 0,05) і кетонових тіл (р < 0,05) при вірогідному зниженні рівня глюкози (р < 0,01). Отже, під впливом введення у раціон сечовини передовсім створюється надлишок аміаку в рубці та посилюються процеси його нейтралізації. Аналогічну картину змін у організмі жуйних за таких умов спостерігали раніше [1, 2, 9].

Згодовування добавок сечовини в поєднанні з природним цеолітом (у співвідношенні 1:2) суттєво згладжує напругу у вищевказаних процесах і значною мірою скеровує їх до нормалізації. Переважно це відбувається завдяки адсорбції аміаку цеолітом у рубці [3, 8] та метаболізації енергетичних запасів для його утилізації [8, 9].

Із доступної літератури нам зовсім невідомо як указані зміни позначаються на обміні речовин у плода й, зокрема в слизовій оболонці його травного тракту. Результати вивчення реакцій трансамінування в ній подано в табл. 3–7.

Встановлено, що на активність AST у цитозоль-мікросомальній і мітохондріальній фракціях клітин слизової впродовж всього травного каналу плода вищевказані зміни в раціоні, рубцевій ферментації й метаболічних процесах корови матері не проявляють суттєвого впливу ( табл. 3 і 4).

Таблиця 3

Активність L-аспартат: 2-оксоглутарат-амінотрансферази ( AST) у цитозоль-мікросомальній фракції слизової ШКТ та печінці 7–8,5 міс. плодів, одержаних від корів із надлишком амонійного азоту в раціоні (мкМоль/хв·мг білку; М±m; n=5)

Органи	Групи тварин
	Контрольна (РШ)	Дослідна-1 (РШ+Сч)	Дослідна-2 (РШ+Сч+Ц)
Рубець	1,72±0,04	1,88±0,10	1,76±0,09
Сітка	1,78±0,08	1,94±0,13	1,82±0,12
Книжка	1,82±0,10	1,99±0,14	1,84±0,11
Сичуг	2,40±0,09	2,58±0,15	2,46±0,11
Сліпа к-ка	2,35±0,07	2,49±0,09	2,39±0,08
Пряма к-ка	2,30±0,08	2,70±0,09*	2,42±0,06
Печінка	2,67±0,08	2,96±0,09*	2,80±0,04

^* р < 0,05 порівняно з контролем

Таблиця 4

Активність L-аспартат: 2-оксоглутарат-амінотрансферази (AST) у мітохондріальній фракції слизової ШКТ та печінці 7–8,5 міс. плодів, одержаних від корів із надлишком амонійного азоту в раціоні (мкМоль/хв·мг білку; М ± m; n = 5)

Органи	Групи тварин
	Контрольна (РШ)	Дослідна-1 (РШ+Сч)	Дослідна-2 (РШ+Сч+Ц)
Рубець	2,31±0,06	2,38±0,11	2,34±0,08
Сітка	2,22±0,08	2,36±0,13	2,28±0,06
Книжка	2,27±0,07	2,44±0,11	2,31±0,08
Сичуг	2,52±0,09	2,64±0,13	2,51±0,11
Сліпа к-ка	2,28±0,04	2,39±0,12	2,26±0,07
Пряма к-ка	2,34±0,05	2,47±0,09	2,35±0,07
Печінка	2,92±0,09	3,21±0,12	3,07±0,10

Таблиця 5

Активність L-аланін: 2-оксоглутарат-амінотрансферази (ALT) у цитозоль-мікросомальній фракції слизової ШКТ та печінці 7–8,5 міс. плодів, одержаних від корів із надлишком амонійного азоту в раціоні (мкМоль/хв·мг білку; М ± m; n = 5)

Органи	Групи тварин
	Контрольна (РШ)	Дослідна-1 (РШ+Сч)	Дослідна-2 (РШ+Сч+Ц)
Рубець	1,12±0,06	1,75±0,12^***	1,28±0,10
Сітка	1,14±0,05	1,87±0,11^***	1,33±0,09
Книжка	1,19±0,09	1,91±0,14^***	1,40±0,11
Сичуг	1,46±0,08	2,09±0,15^***	1,51±0,08
Сліпа к-ка	1,55±0,07	2,37±0,16^***	1,62±0,11
Пряма к-ка	1,73±0,05	2,59±0,13^***	1,77±0,09
Печінка	2,26±0,09	3,07±0,18^***	2,44±0,11

^*** р < 0,001 порівняно з контролем

Таблиця 6

Активність L-аланін: 2-оксоглутарат-амінотрансферази (ALT) у мітохондріальній фракції слизової ШКТ та печінці 7–8,5 міс. плодів, одержаних від корів із надлишком амонійного азоту в раціоні (мкМоль/хв·мг білку; М ± m; n = 5)

Органи	Групи тварин
	Контрольна (РШ)	Дослідна-1 (РШ+Сч)	Дослідна-2 (РШ+Сч+Ц)
Рубець	2,23±0,08	2,84±0,18^***	2,38±0,11
Сітка	2,31±0,11	2,89±0,14^***	2,42±0,15
Книжка	2,38±0,07	2,91±0,22^***	2,56±0,09
Сичуг	2,55±0,09	3,32±0,19^***	2,66±0,12
Сліпа к-ка	2,63±0,12	3,47±0,15^***	2,75±0,11
Пряма к-ка	2,69±0,10	3,54±0,26^***	2,83±0,13
Печінка	2,81±0,06	3,76±0,18^***	2,97±0,08

^*** р < 0,001 порівняно з контролем

Однак активність ALT в обох субклітинних фракціях (під впливом надлишку аміаку в рубці матері) достовірно (р < 0,001) зростає у всіх відділах ШКТ і печінці плода та наближається до рівня контролю при згодовуванні сечовини разом із цеолітовим порошком (табл. 5 і 6). Для пошуку додаткових арґументів пояснення одержаних даних проведено серію досліджень in vitro. В одній з них було показано (табл. 7), що внесення різних рівнів надлишку азоту сечовини в інкубаційне середовище з гомогенатами слизової рубця плода не змінює активність AST i ALT. Але підвищення надлишку аміаку в інкубації пропорційно знижує активність AST, тоді як активність ALT спочатку навіть зростає, потім знижується до попереднього рівня і тільки при найвищій дозі (10 мкмоль) достовірно спадає. Це може вказувати на посилення глюкозо-аланінового циклу в слизовій ШКТ плода, що має суттєве значення для забезпечення енергією реакцій, пов’язаних із знешкодженням надлишків аміаку. Звідси детоксикація аміаку в травній системі плода-матері за умов нестачі достатку енергії (передусім АТР, потрібного для функціонування глутамінсинтетази) супроводжується активацією реакцій за участю аланіну й аланінамінотрансферази. Це узгоджується з даними, одержаними при вивченні шляхів детоксикації аміаку в риб [4] та щурів [5].

Таблиця 7

Вплив рівня надлишку аміаку й сечовини на активність амінотрансфераз у слизовій рубця корови in vitro (мкМоль/хв·мг білку; М ± m; n = 5)

Умови експерименту	Внесення надлишку азоту
	Аміаку	сечовини
L-аспартат: 2-оксоглутарат-амінотрансфераза
контроль	2,29±0,14	2,24±0,09
+1мкМоль	1,90±0,17	2,22±0,28
+5мкМоль	1,50±0,11	2,21±0,24
+10 мкМоль	1,18±0,27	2,29±0,31
L-аланін: 2-оксоглутарат-амінотрансфераза
контроль	2,31±0,08	2,30±0,15
+1мкМоль	2,56±0,24	2,28±0,17
+5мкМоль	2,29±0,15	2,32±0,13
+10мкМоль	1,71±0,17	2,29±0,09

Отже, надлишки аміаку в організмі корови-матері позначаються і на метаболічних процесах у плода. Детоксикація аміаку в травній системі плода за умов дефіциту енергії проходить також шляхом посилення реакцій глюкозо-аланінового циклу. Добавки в раціон матері природного сорбенту, що містить понад 80% клиноптиліту, суттєво знижують цей процес.

____________________

1. Возна О.Є., Калачнюк Г.І., Савка О.Г., Мароунек М., Баран М. Продукти ферментації різних вуглеводів за дії змішаної популяції мікроорганізмів рубця і механізми регуляції // Науковий вісник Львівської державної академії ветеринарної медицини ім. С.З.Гжицького. 2000. Т. 2. № 2. Ч. 2. С. 30–34.

2. Калачнюк Г.І. Симбіоз і біотехнологічні основи підвищення продуктивності тварин // Науковий вісник Львівської державної академії ветеринарної медицини ім. С.З.Гжицького. 2000. Т. 2. № 2. Ч. 2. С. 104–112.

3. Калачнюк Г.І., Фоменко І.С., Лицур Ю.М. та ін. Біологічна дія сорбентів в організмі // Праці 2-го Західноукраїнського симпозіуму з адсорбції та хроматографії. Львів, 2000. С. 203–208.

4. Кулик В.О., Арсан В.О., Коновець І.М., Арсан О.М. Вплив нікелю на функціонування системи детоксикації аміаку у коропа при різних температурах водного середовища // Ecological stress and adaptation in biological systems. Proceedings, 27–29 October, 1998 Ternopil, Ukraine. P. 83–85.

5. Кургалюк Н., Вернюк О., Гальків М. Зміни процесів переамінування, окислення та медіаторного балансу у печінці тварин з різною резистетністю до гіпоксії у процесі виконання динамічної роботи за умов уведення альфа-кетоглутарату натрію // Вісник Львів. ун-ту. Сер. біол. 2000. Вип. 25. С. 94–101.

6. Федець О.М. Ізоформи лактатдегідрогенази та білковий спектр слизової оболонки травного тракту плода корови в онтогенезі, Автореф. дис. канд. с.-г. наук. К., 2000.

7. Фоменко І.С., Калачнюк Г.І. Активність азотфіксуючих ензимів у клітинних компартментах слизової шлунково-кишкового тракту 7-місячного плода корови // Наук. вісн. Львів. держ. акад. ветеринарної медицини. 2000. Т. 2. №2. Ч. 2. С. 251–256.

8. Kalachnyuk G.I. Possibilities of decrease of ammonia formation in the rumen // Problems of protein nutrition of animals. Proc inter. Meet. (Ed. A.Sommer). Nitra: Slov.1996. P. 62–66.

9. Kalachnyuk G.I. Influence of zeolites on the metabolism in ruminants // Recent progress on mineral requirements in ruminants. Proc. Inter. Meet.-Kyoto-Japan. 1989. P. 114–119.