ЗАЛЕЖНІСТЬ СТРУМУ Na⁺–Ca²⁺-ОБМІНУ ПЛАЗМАТИЧНОЇ МЕМБРАНИ ЕКЗОКРИННИХ СЕКРЕТОРНИХ КЛІТИН ВІД ФУНКЦІОНУВАННЯ Na⁺K⁺-ПОМПИ

В. Манько, О. Ларіна, М. Клевець

Львівський національний університет імені Івана Франка,

вул. Грушевського, 4, м. Львів 79005, Україна,

е-mail: vvmanko@altavista.com

Na⁺–Ca²⁺-обмінник, як і інші Са²⁺-транспортні системи, відіграє важливу роль у регуляції гомеостазу Са²⁺ клітин. Для транспорту катіонів Са²⁺ цей вторинно-активний транспортер використовує енергію електрохімічного градієнта Na⁺ через плазматичну мембрану, який створюється первинно-активним транспортером – Na⁺‑K⁺-помпою. Цікаво, що остання в плазматичній мембрані гладеньких м’язів перебуває поряд із молекулою Na⁺–Ca²⁺-антипортера [11]. Також відомо, що в міоцитах шлуночків серця активація Na⁺‑K⁺-помпи зміщує потенціал реверсії струму Na⁺–Ca²⁺-обміну у позитивний бік і, як наслідок, активує роботу обмінника в прямому режимі (виведення Са²⁺ з клітини) [7]. З іншого боку, пригнічення Mg²⁺-залежної Na⁺‑K⁺-АТФази серцевими глікозидами спричиняє збільшення [Са²⁺]_в внаслідок модифікації Na⁺–Ca²⁺-обміну [9, 10]. Отже, ці йонтранспортні системи у збудливих тканинах функціонально пов’язані між собою за фізіологічних умов.

Ми цікавились можливістю залежності Na⁺–Ca²⁺-антипорту від функціонування Na⁺‑K⁺-помпи в екзокринних секреторних клітинах за умов внутрішньоклітинної перфузії, коли вміст йонів Na⁺ у цитоплазмі здебільшого контролюється. Тому ми поставили перед собою мету з’ясувати, чи впливає функціональна активність Na⁺-K⁺-помпи на амплітуду вхідного струму Na⁺–Ca²⁺-обміну, який розвивається у відповідь на раптову гіперполяризацію мембрани.

Дослідження проводили на слинних залозах личинки Chironomus plumosus L. Струм Na⁺–Ca²⁺-обміну (І_Na(Ca)) реєстрували у відповідь на гіперполяризаційне зміщення мембранного потенціалу (МП) від ‑20 до ‑60 мВ з використанням методу фіксації потенціалу за умов внутрішньоклітинної перфузії [4]. Для гіперполяризаційних зміщень використовували прямокутні імпульси тривалістю 3,5 с і частотою 0,1 Гц. Вихідний розчин для внутрішньоклітинної перфузії містив, ммоль/л: трис-Cl – 130,14, NaCl – 16, глюкоза – 5,55; pH 7,0. Для дослідження залежності амплітуди І_Na(Ca) від функціонування Na⁺‑K⁺-помпи 129,14 ммоль/л трис-Cl у цьому розчині замінювали на еквімолярну кількість KCl. Використовували також і внутрішньоклітинний розчин із збільшеною [Na⁺] (до 100 ммоль/л), замінивши відповідну кількість трис-Cl на NaCl, оскільки при цьому активність Na⁺‑K⁺-помпи підвищується. Вихідний позаклітинний розчин мав такий склад, ммоль/л: NaCl – 136,9, KCl – 5,36, CaCl₂ – 1,76, MgCl₂ – 0,49, трис-Cl – 0,20, глюкоза – 5,55; pH 7,2. Для дослідження залежності амплітуди І_Na(Ca) від [K⁺]_з концентрацію NaCl у вихідному позаклітинному розчині зменшували до 120 ммоль/л, а концентрацію KCl зменшували до нуля або збільшували до 20 ммоль/л, компенсуючи зміни осмотичності відповідною кількістю трис-Cl. Як блокатор Na⁺‑K⁺-помпи використовували уабаїн, який додавали до вихідного позаклітинного розчину в концентрації 25 мкмоль/л. У всіх випадках рН розчинів перевіряли перед кожним дослідом за допомогою рН-метра. Дослідження проводили при кімнатній температурі. Статистичне опрацювання даних здійснювали з використанням програмного пакету для персональних комп’ютерів Microsoft Office Excel. Цифрові дані представлені у вигляді (M ± m). Достовірність змін встановлювали за t‑критерієм Стюдента [1].

Для виявлення залежності Na⁺–Ca²⁺-обміну від функціонального стану Na⁺-K⁺-помпи ми досліджували насамперед вплив уабаїну на амплітуду І_Na(Ca). З’ясувалося, що у наведеній вище концентрації уабаїн не викликав ніяких змін струму. Хоча в попередніх дослідженнях встановлено, що строфантин К у такій же концентрації деполяризував мембрану досліджуваних клітин в середньому на 20,9 % (11,7 ± 2,1 мВ; n = 15) за рахунок пригнічення електрогенного ефекту Na⁺-K⁺-помпи [3]. Крім того, строфантин К (1–100 мкмоль/л), пригнічуючи Na⁺-K⁺-помпу, стимулював секрецію амілази клітинами диспергованих ацинусів підшлункової залози щурів за рахунок транспорту Са²⁺ у клітини системою Na⁺–Ca²⁺-обміну [2].

Функціональний стан Na⁺-K⁺-помпи ми змінювати також, варіюючи [К⁺]_з. Відомо, що в безкалієвому середовищі мембрана досліджуваних клітин деполяризується в середньому на 13,6 % (7,6 ± 1,6 мВ; n = 11) завдяки зменшенню активності Na⁺‑K⁺-помпи [3].

З’ясувалося, що між збільшенням амплітуди I_Na(Ca) (16,00±4,72 %), спричиненим підвищенням [К⁺]_з від нуля до 5,36 ммоль/л у середовищі, яке не містило уабаїн, і в середовищі без нього (21,13 ± 6,39 %; рис. 1) не було статистично достовірної різниці. Це вказує на те, що за таких умов (фіксація потенціалу, внутрішньоклітинна перфузія, низька [К⁺]_з) функціональна активність Na⁺-K⁺-помпи помітно не впливає на струм Na⁺–Ca²⁺-обміну. Але подальше збільшення [К⁺]_з від 5,36 до 20 ммоль/л у середовищі без уабаїну збільшувало І_Na(Ca) на (16,56±1,57) %, тоді як за умови блокування ним Na⁺‑K⁺-АТФази – лише на (7,31±2,01) % (рис. 1). Це вказує на наявність чіткої залежності роботи Na⁺–Ca²⁺-обмінника від функціонування Na⁺-K⁺-помпи при підвищеній [К⁺]_з до 20 ммоль/л.

Рис. 1. Зміна амплітуди струму Na⁺-Ca²⁺-обміну внаслідок збільшення [К⁺]_з за відсутності та наявності уабаїну в позаклітинному розчині. Тут і далі: * –  P < 0,05, ** – P < 0,01, *** – P < 0,001.

Ми досліджували зміну І_Na(Ca) і під впливом збільшення [К⁺]_в, припускаючи, що за умов такого підвищення функціонування Na⁺-K⁺-помпи може пригнічуватися. Виявилося, що збільшення [К⁺]_в від нуля до 129,14 ммоль/л призводило до значного зменшення амплітуди І_Na(Ca) (на (79,07±17,06) %). Цікавj, що в двох випадках з шести І_Na(Ca) змінював свій напрям на вихідний, амплітуда якого становила (0,34 ± 0,25) нА (рис. 2). Подібний ефект спостерігався й за умов блокування Na⁺‑K⁺-АТФази уабаїном, але зменшення амплітуди І_Na(Ca) було менш вираженим і становило лише (35,72 ± 11,08) %. Отже, причиною зменшення І_Na(Ca) внаслідок збільшення [K⁺]_в теж є пригнічення активності Na⁺‑K⁺-помпи, хоча наявний й інший вплив катіонів К⁺ на Na⁺-залежний транспорт Ca²⁺.

Рис. 2. Залежність амплітуди струму Na⁺-Ca²⁺-обміну від [К⁺]_в за відсутності та наявності уабаїну в позаклітинному розчині

Отже, за фізіологічної [К⁺]_з уабаїн не впливає на амплітуду І_Na(Ca). Не зважаючи на це, залежність змін І_Na(Ca), спричинених збільшенням позаклітинної та внутрішньоклітинної [К⁺], від наявності уабаїну в середовищі дає змогу нам стверджувати про залежність Na⁺–Ca²⁺-обмін мембрани досліджуваних клітин від функціонування Na⁺‑K⁺-помпи навіть за умов внутрішньоклітинної перфузії.

Внаслідок пригнічення Na⁺‑K⁺-помпи [Na⁺] у внутрішньому примембранному просторі стає дещо більшою, завдяки чого змінюється градієнт Na⁺ і, як наслідок, Na⁺–Ca²⁺-обмін. Про наявність таких примембранних просторів свідчили також і дослідження залежності І_Na(Ca) від функціональної активності Са²⁺-помпи за умов внутрішньоклітинної перфузії [6].

Припущення про те, що вплив функціональної активності Na⁺‑K⁺-помпи на І_Na(Ca) опосередковується зміною градієнту Na⁺ підтверджується наступною серією досліджень. Зменшення [Na⁺]_з від 136,9 до 16 ммоль/л (у цій серії [Na⁺]_в = 100 ммоль/л) спричинило зменшення І_Na(Ca) на (32,53±0,05) % (рис. 3), що й повинно спостерігатися, оскільки функціонування обмінника визначається натрієвим електрохімічним градієнтом. За умов блокування Na⁺‑K⁺-АТФази уабаїном це зменшення становило (41,19 ± 0,06) %. Отже, зменшення [Na⁺] у позаклітинному розчині менш суттєво впливає на роботу обмінника, коли помпа функціонує, ніж коли вона заблокована.

Рис. 3. Зміна амплітуди струму Na⁺-Ca²⁺-обміну завдяки зменшенню [Na⁺]_з за відсутності або наявності уабаїну в позаклітинному розчині

Дещо складніше пояснити ефект зміни позаклітинної й внутрішньоклітинної [K⁺] на Na⁺–Ca²⁺-обмін, який залишається після пригнічення Na⁺‑K⁺-помпи. З даних літератури відомо, що катіони K⁺ можуть котранспортуватися з катіонами Ca²⁺ системою Na⁺–Ca²⁺-обміну деяких клітин (тоді говорять про Na⁺–Ca²⁺, К⁺-обмін) [8]. У цьому випадку зміна градієнта К⁺ повинна порушувати рівноважну [Са²⁺]_в, яка досягається роботою обмінника. Підтвердженням такого типу взаємодії є стимулювання функціонування Na⁺–Ca²⁺-обмінника фоторецепторів поза- або внутрішньоклітинним калієм відповідно в зворотному або прямому режимі [8]. Але ми отримали діаметрально протилежні дані: збільшення [К⁺]_з спричиняло збільшення вхідного струму обміну, що відображає функціонування обмінника в прямому режимі, а збільшення [К⁺]_в – значне його зменшення.

Раніше було показано, що заміна усіх катіонів Na⁺ у позаклітинному розчині еквімолярною кількістю катіонів К⁺ спричиняє суттєве збільшення амплітуди струму, зареєстрованого у відповідь на гіперполяризацію мембрани, за рахунок, очевидно, більшої спорідненості останніх до катіонзв’язуючих ділянок Na⁺–Ca²⁺-антипортера із зовнішнього боку мембрани [5]. Наявність у середовищі натрію та калію призводить мабуть до того, що ці два катіони можуть одночасно або почергово транспортуватися обмінником. Внаслідок цього його активність збільшується, що супроводжується збільшенням амплітуди I_Na(Ca). Можна припустити, що й внутрішньоклітинний калій витісняє натрій з внутрішньоклітинних ділянок зв’язування, транспортується обмінником з клітини і, тому підсилює функціонування обмінника у прямому режимі (за умови, що ділянки зв’язування натрію і кальцію різні). Оскільки сумарний струм обміну відображає різницю між кількістю перенесених катіонами зарядів у клітину і з клітини за одиницю часу, то за таких умов його амплітуда зменшилася б, що й було зареєстровано нами. Проте це припущення вимагає ґрунтовнішої перевірки.

____________________

1. Деркач М.П., Гумецький Р.Я., Чабан М.Е. Курс варіаційної статистики. К., 1977.

2. Гальків М.О., Клевець М.Ю., Гриньків М.Я. Вплив строфантину на екструзію амілази клітинами диспергованих ацинусів підшлункової залози // XIV з’їзд Україн. фізіол. т-ва: Тез. доп. К., 1994. С. 152.

3. Клевец М.Ю. Доказательства електрогенного эффекта натрий-калиевого насоса мембраны секреторных клеток / Львів. ун‑т. Львів, 1985. 11 с. Деп. в УкрНИИНТИ України 22.10.85, №553. Ук 86 Деп.

4. Клевець М.Ю., Манько В.В., Федіpко В.В. Дослідження струму Na–Ca-обміну мембрани секреторних клітин // Доп. HАH Укpаїни. 1995. №11. С. 123–126.

5. Клевець М.Ю., Федірко Н.В., Манько В.В. Спорідненість Na–Ca-обмінника мембрани клітин слинної залози личинки Chironomus рlumosus L. до одновалентних катіонів // Тези доповідей II з'їзду Українського біофізичного товариства, 29 червня – 3 липня 1998 р. Харків, 1998. С. 85.

6. Манько В.В., Клевец М.Ю., Ларина О.А. Зависимость амплитуды тока Na⁺–Ca²⁺-обмена мембраны секреторных клеток от функциональной активности Са²⁺-насоса в условиях внутриклеточной перфузии // ІІ съезд биофизиков России, 23–27 августа 1999 г., Москва: Тезисы докладов. Т. 2. Москва, 1999. С. 537–538.

7. Fugioka, Y., Matsuoka, S., Ban, T., Nama A. Interaction of the Na⁺-K⁺ pump and Na⁺-Ca²⁺ exchange via [Na⁺]_i in restricted space of guinea-pig ventricular cells // J.Physiol. 1998. Vol.509(2). P. 457–470.

8. Lagnado, L., McNaughton, P.A. Electrogenic properties of the Na:Ca Exchange // J.Membrane Biology. 1990. Vol.113. P. 177–191.

9. Langer, G.A. The intristic control of myocardial contraction – ionic factors // New England Journal of Medicine. 1971. Vol.285. P. 1065–1071.

10. Lee, C.O. 200 years of digitals: the emerging central role of the sodium ion in the control of cardiac force // Am.J.Physiol. 1985. Vol.249. P. 367–378.

11. Moore, E.D.W., Etter, E.F., Philipson, K.D. et al. Coupling of Na⁺/Ca²⁺ exchange, Na⁺/K⁺ pump and sarcoplasmic reticulum in smooth muscle // Nature. 1993. Vol.365. P. 657–660.