УДК

ВПЛИВ L-АРГІНІНУ НА ПОКАЗНИКИ АДФ-СТИМУЛЬОВАНОГО ДИХАННЯ МІТОХОНДРІЙ МІОКАРДА В ПРОЦЕСІ АДАПТАЦІЇ ТВАРИН ДО ПЕРІОДИЧНОЇ НОРМОБАРИЧНОЇ ГІПОКСІЇ

Н. Кургалюк

Львівський національний університет імені Івана Франка,

вул. Грушевського, 4, 79005 м. Львів, Україна,

e-mail: biolog@franko.lviv.ua

Кисень відіграє основну роль у енерзозабезпеченні клітин і синтезі АТФ у процесі окиснювального фосфорилювання. Через це дефіцит кисню, тобто гіпоксія, виступає важливим фактором порушення функціонування та ушкодження клітин. До числа причин загибелі організму від гострої гіпоксії відносяться обмеження синтезу макроергічних сполук, спричинене внутрішньоклітинним дефіцитом кисню, пригнічення вищих нервових центрів, що регулюють дихання і кровообіг, виражена стрес-реакція і її ушкоджуючий ефект [5]. Метод переривчастої нормобаричної гіпокситерапії дає змогу імітувати природну фізіологічну циклічність станів помірної гіпоксії, пов’язану з автоколиваннями регуляторних систем, які відповідають за тканинне дихання [9].

Формування захисних ефектів адаптації забезпечується змінами функціонування майже всіх основних систем організму – серцево-судинної, дихальної, нервової, ендокринної, м’язової та ін. Через це у механізмі адаптації найважливішу роль відведено універсальним факторам регуляції фізіологічних систем [7]. Після того, як були отримані результати про значні зміни в продукції оксиду азоту в процесі адаптації тварин до гіпоксії, одразу ж виникло припущення про те, що NO відіграє важливу роль в адаптивних відповідях організму на гіпоксію різного генезу [16, 19].

Дані літератури засвідчують те, що найефективнішим нефармакологічним шляхом стимулювання продукції оксиду азоту є дозована адаптація організму до різних факторів середовища. Встановлено посилення продукції NO в організмі за умов адаптації до тепла, холоду, стресу, гіпоксії, фізичних навантажень. Зокрема, зазначено, що гіпоксія є модулятором продукції NO у судинах [9]. Важка чи хронічна гіпоксія пригнічує синтез NO в ендотелії. Навпаки, за умов помірної гіпоксії, незважаючи на здатність наявності кисню як субстрату, активність еNOS підвищується внаслідок збільшення внутрішньоклітиноої концентрації йонів кальцію, де рівень внутрішньоклітинного кальцію тісно корелює із звільненням ендотеліального NO. Періодично повторювальні нетривалі гіпоксичні впливи помірної інтенсивності супроводжуються транзитoрними підвищеннями внутрішньоклітинної концентрації внутрішньоклітинного кальцію, який активує еNOS. У міру розвитку адаптації (через 2 тижні) в кровоносних судинах збільшується експресія гену NO-синтази, що робить адаптацію надійнішою і тривалішою [9, 10].

Показано, що при адаптації до перідичної гіпоксії в органах і тканинах проходять зміни експресії генів, які кодують різні ізоформи NO-синтаз і судинних NO-залежних реакцій. На користь ролі NO у захисних ефектах адаптації до гіпоксії [8,9] свідчить те, що інгібітори NO-синтаз обмежують розвиток адаптації до гіпоксії. Водночас, питання про те, які конкретні NO-залежні механізми лежать в основі захисної дії адаптації до гіпоксії, залишається відкритим.

Метою нашої роботи було дослідження впливу екзогенного попередника біосинтезу оксиду азоту L-аргініну й блокатора синтази оксиду азоту N^w-нітро-L-аргініну при парентеральному введенні на процеси енергозабезпечення міокарда щурів у процесі інтервальних гіпоксичних тренувань (ІГТ) за умов гострої гіпоксії.

Дослідження проведено на 35 щурах-самцях лінії Вістар масою 0,2-0,22 кг, які утримувались за умов віварію на стандартному раціоні. Перед дослідженням тварин поділили на 5 груп по 7 тварин у кожній. Групу I складали інтактні щури, яким перед дослідом вводили 1 мл фізіологічного розчину. Тварин групи II піддавали дії гострої гіпоксії, для чого їх на 30 хвилин поміщали в обладнану камеру, яка вентилювалась газовою сумішшю з 7% кисню в азоті. Для поглинання вуглекислого газу й водяних парів у камері використовували адсорбент. Перед дослідом цій групі тварин також вводили 1 мл фізіологічного розчину.

Три інших групи використовували в досліді після курсу 14-денних ІГТ. Кожного з цих днів тварин поміщали в камеру, яку почергово впродовж 15-хвилинних інтервалів вентилювали газовою сумішшю з 10 % кисню в азоті або кімнатним повітрям. Кількість циклів становила 5 на день. Щоденно за 30 хв до гіпоксичного тренування цим щурам перентерально вводили: групі III – 1 мл фізіологічного розчину, групі IY – 600 мг/кг L-аргініну фірми “Sigma” (США), групі Y – блокатор синтази оксиду азоту N^w-нітро-L-аргінін L-NNA (35 мг/кг, внутрішньоочеревинно, фірма “Sigma”, США). Наступного дня після останнього тренування всім тваринам проводили тест гострою гіпоксією (30 хвилин дії 7% кисню в азоті), зразу після якого тварин декапітували під ефірним наркозом.

Мітохондрії виділяли методом диференціального центрифугування. Дихання й окисне фосфорилювання у мітохондріях вивчали полярографічним методом [10]. Середовище інкубації для мітохондрій містило (у мМ): сахарозу – 300, KCl – 10, KH₂PO₄–1, ЕДТА – 0,5, трис-НСl – 5, pH 7,2. Як субстрати окиснення використовували 0,35 мМ сукцинату натрію, 1 мМ альфа-кетоглутарату натрію. Добавка ADP становила 200 мкл. За отриманими полярограмами розраховували: стан відносного спокою (V₂), швидкості фосфорилюючого (у метаболічному стані 3 за Чансом, V₃) та контрольованого (у метаболічному стані 4, V₄) дихання МХ, дихальний контроль за Чансом (V₃/V₄), коефіцієнт ефективності фосфорилювання АДФ/О [13]. Концентрацію білка вимірювали за Лоурі [21]. Активність ферментів переамінування аланін- і аспартатамінотрансферази визначали за [11], сукцинатдегідрогенази [2], вміст ТБК-продуктів згідно з [1, 15]. Результати досліджень обробляли статистично, використовуючи критерій t Стьюдента й парний критерій Вілкоксона.

При вивченні стану енергетичного метаболізму за умов дії гострої гіпоксії слід зазначити, що зміни в біохімічних механізмах при адаптації до впливу цього чинника пов’язані з різким зростанням показників АДФ-стимульованого дихання за використання як субстрату окиснення передусім сукцинату (СК). Результати досліджень зведено в табл. 1 і 2. При цьому спостерігається підвищення значення дихального коефіцієнта (за Чансом) і швидкості фосфорилювання доданої АДФ. Однак ефективність використання кисню, що засвідчує значення АДФ/О, значно знижується (на 18,2%). Зменшення концентрації кисню за гіпоксійних умов супроводжується різким пригніченням значень окиснення НАД-залежного субстрату – альфа-кетоглутарату (КГЛ). Для КГЛ встановлене зниження значення дихального коефіцієнта (на 1,9%) і АДФ/О (на 10,2%, p < 0,05). Отже, за умов гострої гіпоксії відбувається перемикання енергетичного забезпечення на використання високоенергетичних ефективних субстратів обміну, пов’язаних із переважним окисленням СК [6].

Тварини, які пройшли 14-денне ІГТ, за умов гострої гіпоксії володіють енергетичним “запасом”, пов’язаним із функціонуванням окиснення СК у дихальному ланцюгу. Це засвідчує зниження значення АДФ-стимульованого дихання за дії стресорного чинника та підвищення ефективності використання кисню для синтезу макроергів (АДФ/О). Отже, ІГТ спричиняє перебудову енергетичного обміну шляхом посилення НАД-залежного окиснення, а це виступає одним із механізмів підвищення резистентності дихального ланцюга за умов гострої гіпоксії [6]. Енергозабезпечення за цих умов відіграє основну роль у механізмах адаптації та його трансформація призводить до підвищення ефективності утилізації енергії у клітині. У процесі тривалої адаптації внесок НАДН-оксидазного окиснення у процесі аеробного утворення енергії збільшується одночасно із здатністю фермента окиснювати НАДН. Одночасно проходять зміни кінетичних характеристик цитохромоксидази. Усе це запобігає інактивації ферментів дихального ланцюга при гіпоксії [7].

Встановлено, що гостра гіпоксія у щурів після ІГТ при щоденному введенні L-аргініну обумовлює зниження значень АДФ-стимульованого дихання МХ стосовно показників гострої гіпоксії і має низку особливостей. За умов окиснення СК спостерігалось зниження значення дихального контролю (на 2,3%) і коефіцієнта АДФ/О (на 8,7%) при підвищенні швидкості фосфорилювання доданої АДФ. Аналогічне зниження значення окисного фосфорилювання встановлене також при окисненні КГЛ, яке супроводжувалося також зменшенням рівня АДФ/О при деякому підвищенні спряженості дихання і фосфорилювання.

За допомогою комплексного дослідження методами електронної мікроскопії показано, що тренування тварин методом переривчастої нормобаричної гіпоксії підвищує вміст у паренхіматозних клітинах серця й печінки вуглеводного енергетичного резерву – глікогену. При цьому глікоген нагромаджується не тільки в цитоплазмі, але й у внутрішньоклітинних органеллах: ядрах, мітохондріях, ендоплазматичному ретикулумі, пероксисомах, лізосомах [5]. Автори вважають, що основним джерелом для синтезу внутрішньоклітинного глікогену є як ті жирні кислоти, що надходять у клітини, так і резервні, які звільнюються із жирових включень. Внутрішньоклітинна трансформація ліпідного енергетичного субстрату у вуглеводний підтримує енергетичний гомеостаз кардіоміоцитів і гепатоцитів у гіпоксичні інтервали ІГТ за рахунок анаеробної ланки гліколізу [3], знижує функціональну активність і пов’язану з нею ушкоджуваність МХ. Тим самим створюються умови для активації у періоди постачання киснем енергопродуктивного забезпечення різноманітних функцій клітин шляхом внутрішньоклітинного окиснювального фосфорилювання як вуглеводних, так і ліпідних субстратів [5]. Оскільки метаболічні перетворення саме сукцинату пов’язані із синтезом жирних кислот, тому, ймовірно, при окисненні цього субстрату отримані високі значення спряженості дихання і ОФ та АДФ/О за умов ІГТ і гострої гіпоксії.

Таблиця 1

Зміни швидкості АДФ-стимульованого дихання мітохондрій міокарда щурів (нг атом О/хв/мг білку) за умов гострої гіпоксії при інтервальних гіпоксичних тренуваннях на фоні дії L-аргініну (600 мг/кг) та блокатора синтази оксиду азоту L-NNA (35 мг/кг) при окисненні 0,35 мМ сукцинату

Умови дослідження	V₃	V₃/V₄	АДФ/О	Vф
Контроль	54,73± 2,27	2,86±0,13	1,59±0,08	123,5±11,5
Гостра гіпоксія	89,94±4,11^*	3,14±0,11	1,30±0,02^*	156,5±14,9
Періодична нормобарична гіпоксія	65,66±3,44^**	3,60±0,45	1,62±0,03^**	173,0±19,0
Періодична нормобарична гіпоксія і L-аргінін	53,49±2,38^**	3,52±0,13	1,48±0,12	87,4±7,9^**
Періодична нормобарична гіпоксія і L-NNA	86,88±6,15	3,62±0,06^**	1,21±0,16	128,5±11,5^**

* Достовірні зміни між контролем і стресом (p < 0,05);

** Достовірні зміни між стресом і введенням L-аргініну та L-NNA

Кінетичні переваги потоку електронів від СДГ обумовлюють зростання ролі СК у загальному окисленні. Тому перехід на переважне окиснення саме цього субстрату вважався основним механізмом підвищення резистентності до гіпоксії. Це підтверджують і наші дослідження про посилення ролі СДГ за зниження вмісту кисню й пов’язані з гальмуванням окиснення НАД-залежних субстратів у аланін- і аспартаттрансаміназних реакціях.

Відомо, що активність СДГ значно перевищує активність інших дегідрогеназ циклу трикарбонових кислот, що призводить до появи захоплення кінцевої цитохромної ділянки дихального ланцюга потоком електронів від СК – явище “монополізації”. Вона проявляється і на початковому рівні дихального ланцюга у формі відновлення НАД-залежних дегідрогеназ шляхом зворотнього перенесення електронів. Активацію окиснення СДГ за умов дії гострої гіпоксії засвідчують результати наших досліджень, наведено в табл. 3.

Таблиця 2

Умови дослідження	V₃	V₃/V₄	АДФ/О	Vф
Контроль	36,24±1,31	3,20±0,14	2,64±0,02	115,71±11,34
Гостра гіпоксія	64,62±4,05^*	3,14±0,23	2,37±0,12^*	134,21±9,56^*
Періодична нормобарична гіпоксія	105,77±5,14^**	3,78±0,58	53±0.04	125,78±14,45
Періодична нормобарична гіпоксія і L-аргінін	73,99±4,10^**	4,64±0,02^*	1,90±0,04^**	78,67±7,34^**
Періодична нормобарична Гіпоксія і L-NNA	109,51±6,55^**	3,72±0,02^**	2,44±0,01	129,21±10,56^**

* Достовірні зміни між контролем і стресом ( p < 0,05);

** Достовірні зміни між стресом і введенням L-аргініну та L-NNA

Сьогодні повністю не з’ясоване питання про те, що виступає тригером метаболічних порушень у клітині за умов кисневої нестачі, який обумовлює інактивацію ферментів дихального ланцюга [18, 19]. Одним із кандидатів на цю роль, як зазначено є зміни внутрішньоклітинного рН. У літературі відмічено різну дію м’якого й значного ацидозу, який супроводжує гіпоксію. Перший активує дихання, що може вказувати на можливість підвищення активності НАД-залежного окиснення. За умов значного ацидозу нагромадження внутрішньоклітинного НАДН, одним із джерел якого може бути підвищення синтезу жирних кислот за умов ранніх стадій гіпоксії, сповільнення регенерації НАД, потрібної для циклу Ембден-Мейергофа, може бути однією з причин зниження окиснення тріоз і збільшення ступення відновленості дихальних переносників мітохондріального ферментного комплексу (МФК) I.

Таблиця 3

Зміни активності ферментів переамінування (аланін-, аспартатамінотрансферази (мкМ/г тк/год) і сукцинатдегідрогенази (нМ сукцинату/мг білку/хв) міокарда в процесі адаптації тварин до періодичної нормобаричної гіпоксії при введенні L-аргініну (600 мг/кг) та блокатора синтази оксиду азоту L-NNA (35 мг/кг).

Умови досліду	Амінотрансферази		СДГ
Умови досліду	АлАт	АсАТ	СДГ
Контроль	336±38	690±21	17,17±0,51
Гостра гіпоксія	245±14	832±18	20,89±1,34*
Періодична нормобарична гіпоксія	314±27	912±28	21,34±2,22
Періодична нормобарична гіпоксія і + L-аргінін	224±16	748±18*	16,77±2,16*
Періодична нормобарична гіпоксія і + L-NNA	322±12	648±28*	22,16±3,42

* Достовірні зміни між контролем і стресом (p < 0,05);

** Достовірні зміни між стресом і введенням L-аргініну та L-NNA

Таблиця 4

Зміни концентрації малонового диальдегіду в крові (нмоль/л) і міокарді (нмоль/г) щурів за умов гострої гіпоксії при адаптації до періодичної нормобаричної гіпоксії і введенні L-аргініну (600 мг/кг) та блокатора синтази оксиду азоту L-NNA (35 мг/кг).

Умови досліду	Кров	Міокард
Контроль	2,24±0,18	2,76±0,21
Гостра гіпоксія	4,71±0,16^*	4,22±0,32^*
Періодична нормобарична гіпоксія	3,19±0,42^*	3,17±0,29
Періодична нормобарична гіпоксія і L-аргінін	2,11±0,16^**	2,55±0,12^**
Періодична нормобарична гіпоксія і L-NNA	3,05±0,12^**	3,76±0,32

* Достовірні зміни між контролем і стресом (p < 0,05);

** Достовірні зміни між стресом і введенням L-аргініну та L-NNA

Іншим фактором патогенезу ушкоджень мітохондрій і порушення функції дихального ланцюга при гіпоксії та ішемії є продукти вільнорадикальних реакцій [12, 20]. Вважають доведеним, що саме активні форми кисню, які продукуються МФК I і III, за цих умов відповідальні за втрату їх активності. Найчутливіший до токсичної дії вільних радикалів МФК I. Отже, продукти вільнорадикальних реакцій найсильніше інактивують транспорт електронів між НАДН-дегідрогеназою та убіхіноном і значно менше – між убіхіноном і цитохромом с [6, 7].

Отже, у каскаді метаболічних перетворень у клітині за умов гіпоксії центральною ланкою регуляції цього процесу залишається аеробна компонента енергетичного обміну [22. 23]. Тому на перший план при захисті організму за умов кисневої нестачі виступає проблема фармакологічної корекції функції мітохондрій і попередження розвитку біоенергетичної гіпоксії [6]. Тривала періодична та особливо інтервальна адаптація до гіпоксії обумовлюють перебудову енергетичного обміну так, що не тільки відновлюють окисну здатність НАД-залежного шляху, а й змінюють кінетичні властивості ферментів дихального ланцюга, особливо мітохондріального ферментного комплексів I і IV. Це виступає механізмом збільшення резистентності дихального ланцюга за умов зниженого вмісту кисню [5, 8].

NO-залежні механізми адаптації обмежують не тільки гіперпродукцію NO, а й специфічні сигнальні шляхи апоптозу, викликані гострою гіпоксією [8]. Це передусім механізм NO-залежної індукції білків теплового шоку, які, можливо, можуть обмежувати вихід цитохрому с із мітохондрій і тим самим захищати клітину від оксидативного стресу [10, 14]. Інший механізм пов’язаний з NO-залежною активацією цГМФ-залежної протеїнкінази, яка в свою чергу інгібує активацію каспаз. Таким шляхом NO може оберігати клітину від апоптозу навіть після активації каспаз. Встановлено, що NO безпосередньо може інгібувати звільнення цитохрому с з мітохондрій [6. 12, 23].

Як зазначено в літературі, дозована помірна гіпоксія в інтервальному режимі викликає посилення опосередкованих ендотелієм реакцій і сприяє захисній дії за умов дефіциту оксиду азоту [6, 16]. Показано, що передусім це обумовлене поступовим збільшенням концентрації у плазмі стабільних метаболітів NO – нітритів і нітратів, які відображають сумарну продукцію NO в організмі [9]. Зокрема, встановлене подвійне збільшення продукції NO після 45-денного курсу адаптації. При цьому в стінці судин формується і закономірно зростає об’єм депо оксиду азоту. На всіх етапах формування адаптації до гіпоксії депо NO корелює з концентрацією нітратів і нітритів у плазмі.

Так, під впливом ІГТ проходить структурно-функціональна внутрішньоклітинна перебудова, спрямована на підтримання енергетичного обміну шляхом використання найактивніших енергетичних субстратів, зокрема, шляхом конверсії ліпідних енергетичних субстратів у вуглеводні. Тобто, при тренуванні до переривчастої нормобаричної гіпоксії у клітинах створюється і закріплюється той структурно-функціональний комплекс пристосувань, який визначений Ф.З.Меєрсоном як “системний структурний слід”.

Тому поєднання адаптивних властивостей організму з вмілою фармакологічною корекцією при використанні попередників біосинтезу оксиду азоту може відігравати важливу роль як засіб профілактики гіпоксичних станів.

___________________

1. Гаврилов В.Б., Гаврилова А.П., Мажуль Л.М. Анализ методов определения продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови по тесту с тиобарбитуровой кислотой// Вопр. мед. химии, 1987. Т. 33. №1. С. 118–122.

2. Ещенко Н.Д., Вольский Г.Г. Определение количества янтарной кислоты и активности сукцинатдегидрогеназы. Методы биохимических исследований. Л., 1982. С. 207–212

3. Каминский Ю.Г., Косенко Е.А. Парадоксы углеводного обмена. Пущино, 1988. 78 с.

4. Лебкова Н.П. Трансформация липидов в гликоген в клетках животных и человека //Арх. Патологии, 1982. №6. С. 68–76.

5. Лебкова Н.П., Чижов А.Я., Бобков Ю.И. Адаптационные внутриклеточные механизмы регуляции энергетического гомеостаза при прерывистой нормобарической гипоксии //Рос. физиол. журн. им. И.Сеченова. 1999. Т.85. №3. С. 403–411.

6. Лукьянова Л.Д. Биоэнергетическая гипоксия: понятие, механизмы и способы коррекции // БЭБиМ. 1997. Т. 124. №9. С. 244–254.

7. Лукьянова Л.Д. Современные проблемы гипоксии //Вестн. РАМН. 2000. №9. С. 3–12.

8. Малышев И.Ю., Монастырская Е.А., Смирин Б.В., Манухина Е.Б. Гипоксия и оксид азота // Вестн. РАМН. 2000. №9. С. 44–48.

9. Манухина Е.Б., Малышев И.Ю., Архипенко Ю.В. Оксид азота в сердечно-сосудистой системе: роль в адаптационной защите // Вестн. РАМН. 2000. №4. С. 16–21.

10. Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К., Реутов В.П. Оксид азота и NO-синтазы в организме млекопитающих при различных функциональных состояниях //Биохимия. 2000. Т. 65. Вып. 4. С. 485–503.

11. Осадчая Л.М. Определение активности аминотрансфераз в тканях. Методы биохимических исследований. Л., 1982. С. 246–250.

12. Реутов В.П., Сорокина Е.Г., Охотин В.Е., Косицын Н.С. Циклические превращения оксида азота в организме млекопитающих. М., 1998.

13. Руководство по изучению биологического окисления полярографическим методом. М., 1973.

14. Смирин Б.В., Покидышев Д.А., Малышев И.Ю., Ванин А.Ф. Манухина Е.Б. Депонирование оксида азота как фактор адаптационной защиты //Рос. физиол. журн. им. И.Сеченова. 2000. Т.86. №4. С. 447–454.

15. Тимирбулатов Т.А., Селезнев С.И. Метод определения интенсивности свободнорадикального окисления липидсодержащих компонентов крови и его диагностическое значение //Лаб. дело. 1988. № 4. С. 209–211.

16. Brown G.C. Nitric oxide and mitochondrial respiration //Biochim. Biophys. Acta. 1999. Vol.1411. (2–3). P. 351–369.

17. Chance B., Williams G. The respiratory chain and oxidative phosphorylation // Adv. Enzymol. 1956. Vol.17. P. 65–134.

18. Giuffre A., Sarti A., D’Itri E. et al. On the mechanism of inhibition of cytochrome c oxidase by nitric oxide // J. Biol. Chem. 1996. Vol.271. P. 33404–33408.

19. Giulivi C. Functional implications of nitric oxide produced by mitochondria in mitochondrial metabolism // Biochem. J. 1998. Vol.332. P. 673–679.

20. Henry Y., Guissani A. Interactions of nitric oxide wiyh hemoproteins: roles of nitric oxide in mitochondria //Cell. Mol.Life Sci. 1999. Vol.55. P. 1003–1014.

21. Lowery O.H., Rosebrough N.I., Farr A.L., Randall R.I. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol.Chem. 1951. Vol.193. N1. P. 265–275.

22. Okada S., Takehara Y., Yabuki M. et al. Nitric oxide, a physiological modulator of mitochondrial function // Physiol. Chem. Phys. Med. NMR. 1996.Vol.28. P. 69–82.

23. Stadler J., Billar T., Curran R. et al Effects of exogenous and endogenous nitric oxide on mitochondrial respiration of rat hepatocytes // Amer. J. Physiol. 1991. Vol.260. P. 910–916.