ВПЛИВ L-АРГІНІНУ Й БЛОКАТОРА СИНТАЗИ ОКСИДУ АЗОТУ N^w-НІТРО - L-АРГІНІНУ НА СТАН КАЛЬЦІЄВОЇ ЄМНОСТІ МІТОХОНДРІЙ ПЕЧІНКИ ЩУРІВ ІЗ РІЗНОЮ РЕЗИСТЕНТНІСТЮ ДО ГІПОКСІЇ ЗА УМОВ ДІЇ СТРЕСОРНИХ НАВАНТАЖЕНЬ

Н. Кургалюк, О. Іккерт, О. Горинь, М. Гальків, С. Гордій

Львівський національний університет імені Івана Франка,

вул. Грушевського, 4, м. Львів 79005, Україна,

e-mail: biolog@franko.lviv.ua

Дослідженнями впливу нітратів і нітритів, із якими пов’язане функціонування циклу оксиду азоту (NO) [5, 11], як і дія донорів NO, встановлене пригнічення окисно-відновних процесів у мітохондріях (МХ), зниження активності ферментів енергетичного обміну (сукцинатдегідрогенази, цитратсинтази), акцептування електронів цитохромоксидазою на NO₂^-. Утворення оксиду азоту в NO-синтазних реакціях пов’язане з роллю йонів кальцію й залежить від змін концентрацій енергетичних субстатів (альфа-кетоглутарат (КГЛ), піруват, глутамат – група НАД-залежних і сукцинат (СК) – ФАД – залежні). Різні шляхи надходження відновлених еквівалентів до дихального ланцюга МХ залежать від чутливості до гіпоксичного фактора й обумовлюють резистентніть до різних шкідливих чинників довкілля [3, 4]. Враховуючи важливу роль оксиду азоту в процесах сиґнальної передачі, реалізації функцій МХ, секреції медіаторних речовин, ми досліджували ефекти парентерального введення L-аргініну й блокатора синтази оксиду азоту N^w-нітро-L-аргініну

L-NNA на стан кальцієвої ємності й окиснювального фосфорилування МХ печінки високо- (ВР) і низькорезистентних (НР) щурів за умов використання різноманітних субстратів енергетичного обміну за дії стресорних навантажень, які з’ясовані в літературі недостатньо.

Дослідження проведено на 48 щурах-самцях лінії Вістар масою 200–220 г, які утримувалися на стандартній дієті. Тварин попередньо розділяли за їх резистентністю до гіпобаричної гіпоксії на НР і ВР за методом [1]. Реакцію тварин на гостру гіпоксію оцінювали за часом їхнього перебування на “висоті” 12 000 м (“підйом” у барокамері) до появи другого агонального вдоху або судом. У ВР тварин він становив 7 хвилин і більше, у НР – до 2 хвилин

Як метод стресування піддослідних тварин використали наведений у літературі [2] екстремальний вплив, пов’язаний з вільним плаванням щурів у клітці, закритій сіткою, відстань від води до сітки в якій становила 5 см. Температура води – 220° С. Час плавання – 30 хв. ВР і НР тваринам вводили внутрішньоочеревинно перед плаванням у кількості 1 мл: фізіологічний розчин, L-аргінін (600 мг/кг, фірми “Sigma”, США) – та блокатор синтази оксиду азоту Nw-нітро- L-аргінін L-NNA (35 мг/кг, фірми “Sigma”, США). Час дії кожного препарату становив 30 хвилин. Тварин декапітували одразу після плавання.

МХ печінки виділяли за схемою досліду, що дає змогу зберігати нативність ізольованих мітохондрій методом диференціального центрифугування. Вихід Н+ з МХ печінки реєстрували за допомогою РН-метричної установки, зібраної на базі водневого електрода ЭСЛ-43-07, універсального іонометра ЭВ-74, самописця КСП-4, магнітної мішалки для розмішування суспензії та скляної термостатованої відкритої комірки об’ємом 2 мл. Середовище інкубації містило (ммоль/л): KCl – 120, KH2PO4 – 2, Hepes – 10, pH 7,2. У середовище вносили 4–5 мг мітохондріального білка. Відповідно до умов інкубації додатково вносили сукцинат (0,35 мМ), альфа-кетоглутарат (1 мМ), малонат (2 мМ) натрію. Розчини всіх речовин, які додавали в комірку, попередньо доводили до рН середовища інкубації. Температура інкубації становила 260°С. Кількість йонів Н+, які виділялись із МХ, розраховували з урахуванням буферної ємності середовища інкубації шляхом його титрування 0,01 М НCl. Ми застосовували фізіологічні добавки СаCl2 (по 100 нмоль) за умов відсутності в середовищі інкубації АТФ і Mg2+. За таких умов немає масивного нагромадження кальцію у матриксі МХ, пошкодження їх мембрани та роз’єднання дихання й окисного фосфорилювання. На підставі рН-метричних записів розраховували кальцієву ємність МХ [6, 10]. При визначенні кальцієвої ємності МХ, тобто максимальної кількості кальцію, яку вони можуть поглинути, в суспензію цих органел послідовно вносили декілька невеликих добавок кальцію. При субмаксимальному рівні навантаження кальцієм у відповідь на внесення Са2+ у середовище інкубації МХ спостерігалось його закислення. Величину кальцієвої ємності реєстрували після настання швидкого виходу Са2+ з МХ у середовище інкубації, яке супроводжується його залужненням. Показник кальцієвої ємності МХ визначали в нмоль Са2+/мг білка. В основу розрахунку виходу йонів Н+ була покладена стехіометрія виходу йонів Н+ у середовище інкубації МХ при поглинанні ними йонів Са2+ - 1Н+/1 Са2+ . Результати досліджень обробляли статистично, використовуючи критерій Стьюдента.

Поглинання йонів Са2+ МХ печінки щурів з різною резистентністю до гіпоксії засвідчило в контролі неоднакові значення стосовно використання ендогенних та інших субстратів енергетичного обміну, зокрема інтермедіатів циклу трикарбонових кислот. Це свідчить про різну здатність МХ високо- (ВР) і низькорезистентних (НР) до гіпоксії тварин щодо активації дихального ланцюга, який у кінцевому підсумку здатний підтримувати відновлення мембранного потенціалу, пов’язане з виходом назовні йонів Н+ [10]. Отримані результати досліджень подано в таблицях 1–3.

Зокрема це стосується вихідних значень кальцієвого нагромадження МХ при використанні ендогенних субстратів, сукцинату й альфа-кетоглутарату натрію, які вірогідно вищі у ВР тварин: на 97,8% у першому випадку, 97,92% і 97,38% у другому й третьому. Можливо, це дає вагомі переваги ВР організмам за умов дії стресорних навантажень і сприяє зменшенню негативних ефектів порушення кальцієвого гомеостазу, який лежить у основі патогенезу ряду захворювань.

Наші результати засвідчують важливу роль внеску окиснення НАД-залежних субстратів у підтриманні кальцієвого транспорту мітохондріальною мембраною у ВР щурів, оскільки за умов дії значних стресорних навантажень отримано вірогідне зниження цього показника як при окисненні ендогенних субстратів, так і екзогенного КГЛ. Аналогічні зміни для НР тварин встановлені не були. Саме ці ефекти зазначено в деяких працях М. Лук’янової як фактор, що пов’язаний з порушеннями першого пункту спряження дихального ланцюга (комплексу I) за умов дії екстремальних чинників довкілля й узагальнений під терміном біоенергетична гіпоксія [4].

Зокрема роль ендогенних підтоків субстратів за умов введення попередника біосинтезу оксиду азоту L-аргініну в щурів із різною резистентністю до гіпоксії неоднозначна: для НР тварин вона не супроводжується змінами кальцієвої ємності МХ, для ВР щурів, навпаки, значно знижується. Про це зазначено в деяких працях [3, 4], оскільки резистентність до гіпоксичного чинника обумовлена різними фізіологічними механізмами, пов’язаними з посиленням функціонування адренергічної для НР і парасимпатичної ланок регуляції для ВР.

Вплив блокатора синтази оксиду азоту за умов стресу не посилював здатності МХ печінки нагромаджувати йони кальцію для НР щурів і значно підвищував для ВР. Ймовірно, вихідні механізми NO-ергічного обміну в цих груп організмів різні, тому для ВР щурів посилення цієї ланки обміну за умов стресу введенням попередника синтезу оксиду азоту викликає інгібування аеробної компоненти дихання більшою мірою, ніж у НР. Введення L-NNA нівелювало ефекти екзогенного введення L-аргініну саме в групі ВР щурів, для НР тварин аналогічні показники значно не відрізнялись від значень, отриманих за умов дії стресорних навантажень.

Таблиця 1

Зміни кальцієвої ємності (нмоль Са²⁺/мг білка) мітохондрій печінки високо- й низькорезистентних до гіпоксії щурів за умов парентерального введення L-аргініну (600 мг/кг) і блокатора синтази оксиду азоту L-NNA (35 мг/кг) при окисненні ендогенних субстратів

Умови досліду	Низькорезистентні щурі	Високорезистентні щурі
Контроль	85,33±18,98	184,2±14,33
Cтрес	189,47±6,93*	124,6±9,33*
L-аргінін	186,31±12,3	81,52±7,84**
L-NNA	170,521,79	204,73±16,72**

* Достовірні зміни між контролем і стресом (p < 0,05);

** Достовірні зміни між стресом і введенням препаратів.

Використання сукцинату (СК) для встановлення кальцій-акумулюючої здатності МХ печінки НР щурів під впливом стресу було вищим (на 172,6%, p < 0,01) стосовно аналогічних показників у ВР тварин (19,6%, p < 0,05). Отже, викликане СК підвищення кальцієвої ємності МХ засвідчує важливу роль цього субстрату в процесах енергозабезпечення НР організмів, а різниця у відсотках змін показників узгоджується із встановленими раніше ефектами напруження роботи дихального ланцюга при виконанні аналогічних навантажень у досліджуваних НР і ВР групах. Вплив L-аргініну вірогідно обмежував ефекти кальцієвого транспорту в обох групах, і лише для ВР тварин введення блокатора ситетази оксиду азоту L-NNA призводило до посилення ефекту кальцієвого нагромадження.

Первинний механізм дії донорів оксиду азоту пов’язують з активацією розчинної форми гуанілатциклази, що викликає підвищення вмісту внутрішньоклітинної концентрації цГМФ – вторинного месенджера клітинної активності [5, 8]. Припустимо, що ефекти оксиду азоту реалізуються за участю тіолів та гемопротеїнів, глутатіон-S-трансферази та ін. ферментів. Певна роль у цих процесах належить системі цитохрому Р-450, яка бере участь у метаболізмі органічних нітратів і обумовлює накопичення NO [11]. У процесі активації гуанілатциклази під дією NO значна роль відводиться сульфгідрильним групам, зменшенню впливу йонів кальцію внаслідок блоку надходження йонів через потенціалозалежні канали мембрани. Це призводить до зменшення мобілізації кальцію з внутрішньоклітинних депо (ендоплазматичний ретикулум та мітохондрії), активації механізмів виведення кальцію з клітини, стимуляції захоплення йонів кальцію та його накопичення у внутрішньоклітинних депо [12]. Але основним компонентом серед цих реакцій вважається блокада входу йонів кальцію до клітини через хемочутливі кальцієві канали й безпосередній вплив цГМФ на активність Ca²⁺ – Mg²⁺ -ATФ-ази.

Таблиця 2

Зміни кальцієвої ємності мітохондрій (нмоль Са²⁺/мг білка) печінки високо- й низькорезистентних до гіпоксії щурів за умов парентерального введення L-аргініну (600 мг/кг) і блокатора синтази оксиду азоту L-NNA (35 мг/кг) при окисненні екзогенного сукцинату (0,35 мМ)

Умови досліду	Низькорезистентні щурі	Високорезистентні щурі
Контроль	140,31±16,31	290,52±14,11
Cтрес	382,09±11,10*	347,36±22,0
L-аргінін	251,11±20,86**	289,0±9,20**
L-NNA	208,4± 10,10**	395,7±18,10

* Достовірні зміни між контролем і стресом (p < 0,05);

** Достовірні зміни між стресом і введенням препаратів.

Використання як субстрату окиснення КГЛ і введення L-аргініну обумовлювало в НР тварин вірогідне зниження кальцієвої ємності МХ. Введення блокатора синтази оксиду азоту L-NNA за використання як СК так і КГЛ, вірогідно, знижувало кальцієвий транспорт у НР. Для ВР щурів вплив L-NNA, навпаки, значно підвищував кальцієву ємність МХ при використанні як субстрату окиснення СК і КГЛ. Отже, гіперпродукція оксиду азоту, яка зазначена в деяких працях при дії екстремальних навантажень на організм, може ефективно обмежуватися у ВР організмів при введенні блокаторів його синтезу й не може використовуватись як засіб коригувального впливу на енергозабезпечення за цих умов для НР.

Можливо, така дія пояснюється високими вихідними значеннями Са²⁺ акумулюючої здатності МХ печінки ВР організмів і засвідчує важливу роль цього НАД-залежного субстрату окиснення дихального ланцюга. Відомо, що альфа-кетоглутаратдегідрогеназа є кальцій-залежним ферментом і викликає зміни енергозабезпечення цим субстратом за умов дії сильних стресорних показників.

Відомо, що оксид азоту може безпосередньо впливати на стан МХ дихання, бо має вище K_m ніж кисень. Однак для багатьох процесів організму таке інгібування МХ дихання, що викликає робочу тимчасову гіпоксію з перемиканням обміну на гліколітичний шлях, зворотнє і забезпечується багатьма регуляторними механізмами підтримання постійної концентрації NO у фізіологічних межах [7]. Цитотоксичні концентрації оксиду азоту (1000 разів і вище) незворотньо інгібують МХ дихання. Зокрема, за цих умов на 50% знижена активність аконітази без зміни активностей цитратсинтази й альфа-кетоглутаратдегідрогенази. При цьому збільшується концентрація лактату на 50%, що засвідчує зростання гліколітичного шляху порівняно з окисненням [5]. Відомо, що фермент синтезу оксиду азоту міститься у МХ, гістохімічні дослідження показали пряму кореляцію між активністю NO-синтази МХ-ної сукцинатдегідрогенази. МХ діафрагми, серця, м’язів і нирок щурів містять кальцій-залежну NOS, додавання донора оксиду азоту в концентрації 100 μМ за цих умов призводило до зниження дихання МХ на 50% через інгібування цитохром с редуктази й аконітази [7].

Таблиця 3

Зміни кальцієвої ємності мітохондрій (нмоль Са²⁺/мг білка) печінки високо- й низькорезистентних до гіпоксії щурів за умов парентерального введення L-аргініну (600 мг/кг) і блокатора синтази оксиду азоту L-NNA (35 мг/кг) при окисненні альфа-кетоглутарату (1 мМ)

Умови досліду	Низькорезистентні щурі	Високорезистентні щурі
Контроль	103,16±5,81	269,46±12,14
Cтрес	333,15±13,73*	205,78±16,31
L-аргінін	165,40±13,64**	131,11±2,36**
L-NNA	129,47± 15,05**	241,07±9,45

* Достовірні зміни між контролем і стресом (p < 0,05);

** Достовірні зміни між стресом і введенням препаратів.

З оксидом азоту, що вивільнюється в організмі з амінокислоти L-аргініну, пов’язують регуляцію систем внутрішньоклітинної сигналізації [11]. Одним із таких механізмів виступає активація синтезу оксиду азоту, збільшення внутрішньоклітинної цГМФ й активація через систему G-кіназ Са²⁺-помп ендоплазматичного ретикулуму, регуляція звільнення йонів кальцію [9] з пулу, нечутливого до ІР₃, але чутливого до дії самих йонів Са²⁺ і АDP-рибозилтрансферази. З іншого боку, оксид азоту може впливати на проникливість кальцієвих каналів, що зумовлює його важливу роль у процесах внутрішньоклітинної передачі, який реалізує свій вплив через ланку цГМФ.

Отже, проведені дослідження встановили існування регуляторних механізмів у реалізації ефектів L-аргініну на кальцієву ємність мітохондрій печінки високо- й низькорезистентних до гіпоксії тварин, що може мати значення в корекції енергозабезпечення профілактики станів, які супроводжуються гіпоксією.

_____________________

1. Березовський В.А. Риси індивідуальності в реакції на гіпоксію // Фізіол.журн. 1975. Т.21. №3. С. 371–376.

2. Бондаренко О.Н., Бондаренко О.А., Манухина Е.Б. Влияние различных методик стрессирования и адаптации на поведенческие и соматические показатели у крыс // Бюл. экспер. биол. и мед. 1999. Т. 126. №8. С.157–160.

3. Кургалюк Н.М., Шостаковська І.В. Вплив альфа-кетоглутарату натрію на активність ферментів переамінування та сукцинатдегідрогенази у щурів з різною резистентністю до гіпоксії //Фізіол. журн. 1999. Т. 45. №6. С. 51–58.

4. Лукьянова Л.Д., Романова В.Е., Чернобаева Г.Н. Особенности окислительного фосфорилирования в митохондриях мозга крыс с различной чувствительностью к кислородной недостаточности // Бюл. экспер. биол. и мед. 1991. №7. С. 49–51.

5. Реутов В.П., Сорокина Е.Г., Охотин В.Е. и др. Циклические превращения оксида азота в организме млекопитающих. М., 1998.

6. Akerman K. Effect of pH and Ca²⁺ on the retention of Ca²⁺ by rat liver mitochondria // Arc. Biochem.Biophys. 1978. Vol. 189. N2. P. 256–262.

7. Andersson U., Leighton B., Young M.E. et al. Inactivation of aconitase and oxoglutarate dehydrogenase in skeletal muscle in vitro by superoxide anions and/or nitric oxide // Biochem. Biophys. Res. Commun.1998. Vol.249. N2. P. 512–516.

8. Bates T., Loesch A., Burnstock G. and Clark J.B. Mitochondrial nitric oxide synthase: a ubiquitous regulator of oxidative phosphorylation? // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. Vol. 218. N1.P. 40–44.

9. Beatrice M.C., Palmer J., Pfeiffer D. The relationship between mitochondrial membrane permeability, membrane potential and the retention of Ca²⁺ by mitochondria // J. Biol. Chem.1980. Vol. 255. N18. P. 8663–8671.

10. Nicholls D., Akerman K. Mitochondrial calcium transport // Biochim.Biophys. Acta. 1982. Vol. 683. N1. P. 57–88.

11. Shen W., Hintze T.H., Wolin M.S. Nitric oxide. An important signaling mechanism between vascular endothelium and parenchymal cells in the regulation of oxygen consumption // Circulation. 1995. Vol.921. N2. P. 3505–3412.

12. Stadler J., Billiar T.R., Curran R.D. et al. Effect of exogenous and endogenous nitric oxide on mitochondrial respiration of rat hepatocytes //Am. J. Physiol. 1991. Vol.260. P. 910–916.