ВПЛИВ ПРООКСИДАНТІВ ТА ІНГІБІТОРІВ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕННЯ ЛІПІДІВ НА СХОЖІСТЬ НАСІННЯ Lepidium sativum L. В УМОВАХ ЛАЗЕРНОЇ СТИМУЛЯЦІЇ РОСТУ

К. Скварко

Львівський національний університет імені Івана Франка,

вул. Черемшини, 44, м. Львів 79014 Україна,

е-mail biolog@franko.lviv.ua

Нещодавно Д.М.Гродзінським і співробітниками [7] показана участь реакцій перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) у реалізації фізіологічного спокою та проростання насіння. Перебування насіння в стані фізіологічного спокою зумовлено стабільністю системи реакцій ПОЛ. Вихід насіння із стану фізіологічного спокою – наслідок релаксації реакцій ПОЛ, у результаті якої встановлюється потрібний для виникнення автоколивань рівень антиокисної активності (АОА) ліпідів [8]. Автоколивання в системі реакцій ПОЛ виникають у певному інтервалі значень АОА ліпідів. Це відповідає певній швидкості виникнення перекисних радикалів, при якій можливі ці автоколивання. Оптимальному варіанту проростання насіння відповідає така швидкість виникнення радикалів, при якій реакції ПОЛ у мембранах клітин зародка знаходяться в середині інтервала існування автоколивань. Незначне прискорення виникнення радикалів за рахунок дії пероксиданта не повинно порушити умови існування автоколивань ліпідів і тоді не буде змінюватись схожість насіння. Зміщення реакцій ПОЛ до межі інтервалу існування автоколивань і підвищення швидкості виникнення радикалів може суттєво вплинути на проростання насіння. Це досягається інгібіторами ПОЛ.

Антиоксидантна роль аскорбінової кислоти ґрунтується на її реакцiї з водорозчинними пероксид–радикалами з утворенням аскорбiл–радикалiв [12]. Хоча аскорбат присутнiй у воднiй фазi, вiн може захистити лiпiди i мембрани вiд окисного пошкодження шляхом ефективного зв’язування (вловлювання) радикалiв, що iнiцiювали ПОЛ.

Токоферол, як і iншi природнi антиоксиданти, проявлє антимутагенну та антиканцерогенну дiю, а його дефiцит посилює ефект генотоксичних сполук. Нещодавно висунена гiпотеза, згiдно якої токоферол забезпечує функцiонування лiпiднорадикальних циклiв i перетворення енергiї в мембранах [3].

Ми використали низькоенергетичнi гелiй-неоновi лазернi генератори як джерело монохроматичного, когерентного, поляризованого свiтла з довжиною хвилi 0,63 мкм. У цiй зонi спостерiгається максимальне поглинання свiтла хлорофiлом, очевидно, тому бiологiчна дiя лазерної радiацiї є безсумнівною. Для покращення насіннєвих показників та виведення насіння із фізіологічного спокою уже давно використовуються випромінювання різноманітних оптичних квантових генераторів [4; 6; 9]. Раніше маркером їх дії служили здебільшого фенотипічні спостереження та оцінка врожайності. Сьогодні механізм біологічної дії лазерної радіації досліджено ще недостатньо. Зрозуміло, що інгібуюча дія прооксидантів повинна бути іншою в умовах лазерної фотоактивації росту та зменшуватися під впливом антиоксидантів. Перевірка положень про участь реакцій ПОЛ у регуляції фізіологічного спокою і проростання насіння є основною метою нашої роботи.

У дослідах використано насіння хрінниці посівної (крес-салат, Lepidium sativum L.) врожаю 1999 р., яке вирізнялось високою швидкістю проростання та 100% схожістю. Рослини в умовах відкритого ґрунту на експериментальних ділянках ботанічного саду швидко росли і добре розвивалися, період вегетації “від насіння до насіння“ залишався в межах 3–3,5 місяців.

Для вивчення впливу про- та антиоксидантів на схожість насіння хрінниці посівної в умовах лазерної стимуляції росту його пророщували на фільтрувальному папері в чашках Петрі (25 ± 2 насінин на чашку діаметром майже 9 см). У кожну чашку наливали 5 мл дистильованої води або розчину про- та антиоксидантів. Насіння пророщували в темряві, у термостаті при температурі 24°С. Для посилення швидкості виникнення окисних радикалів вносили 0,1, 0,2 та 0,3% перекис водню. Реакції ПОЛ інгібували a-токоферолом (ТФ) у концентрації 1´10^–2 М, 2´10^–2 М і 4´10^–2 М та 0,025% аскорбіновою кислотою (АК), яка, на відміну від стандартного антиоксиданта a-токоферолу, легко розчиняється у воді, що й зумовило наш вибір. Досліди проводилися у чотирикратній повторності.

Лазерне опромiнення рослинних об'єктiв проводили за методикою передпосiвної обробки насiння, розробленої в бiофiзичнiй лабораторiї ботанiчного саду Львiвського унiверситету [10]. Його ефективнiсть здебільшого залежить вiд фiзичних властивостей промiння, густини випромінювання та довжини хвилi. В роботі використали лазерні установки типу ЛГ-1, ЛГ-126, ЛГН-104, що генерують монохроматичне свiтло з довжиною хвилi 0,63, 1,5 та 3,39 мк, потужнiсть випромiнювання становила Р = 20 – 50 мВт/см². Результат дiї лазерних променiв залежить вiд тривалостi експозицiї, а також режиму роботи оптичних квантових генераторiв. Вище згаданi лазернi апарати працюють у неперервному режимi. Дискретнiсть лазерних променiв досягалась з допомогою двовипуклої лiнзи, яку встановлювали на шляху лазерного променя, направленного в заданiй площинi вiдбиваючою зеркальною системою. Скануючий режим опромiнення досягали за допомогою сканера СУ-1, дiюча модель якого була ще 1995 р пiдготовлена для виробничих випробувань у КБ ВО (Полярон). СУ-1 розрахований на спiльну роботу з ЛГН-104 i забезпечує покадрову (P = 87 Гц ) та рядкову (P = 14 Гц ) розгортку променя при густинi випромiнювання Р = 0,8 – 1,0 мВт/см².

Ефект лазерного випромiнювання дослiджували емпiрично, шляхом попереднього визначення стимулюючих доз та режимiв опромiнення в лабораторних умовах. Оцiнка ефективностi експозицiй лазерного опромiнення проводилась по лабораторнiй схожостi й швидкостi проростання насіння. Польові дослiди проводили на основi лабораторних аналiзiв ефективностi лазерного випромiнювання. Впродовж всього перiоду вегетацiї за рослинами проводили фенологічні спостереження.

Таблиця 1

Вплив низькоенергетичного лазерного випромінювання різної довжини хвилі на схожість насіння крес-салату

l, мк	Доза, Дж	Схожість насіння, % через діб						Схожіть насіння, % M ± m
		1		2		3
		М ± m		М ± m		M. ± m
Контроль		90,3	1,0	96,6	0,9	97,0	1,0	97,0 0,8
0,63	0,3	91,5	1,3	95,5	1,3	96,0	0,8	96,0 0,5
	0,6	88,5	2,9	95,5	1,5	96,5	1,5	96,5 0.,
	0,9	94,0	2,2	97,5	1,3	97,5	1,3	97,5 0,7
	1,2	92,5	3,9	97,0	2,4	97,5	1,9	97,5 0,9
1,15	0,34	90,0	2,2	97,5	0,5	98,5	0,9	98,5 0,5
	0,69	91,5	2,9	97,5	1,5	98,0	1,9	98,0 0,9
	1,04	84,0	2,1	95,5	1,5	96,0	1,5	96,0 0,8
	1,38	90,0	5,4	94,5	3,2	95,5	2,9	95,5 1,4
3,39	1,38	90,0	4,9	97,0	1,3	97,5	0,9	97,5 0,5

Деякі дослідники вважають, що передпосівна лазерна обробка насіння забезпечує тільки позитивний ефект [4, 5]. Інші заперечують всяку можливість стимулювати ріст і розвиток рослин лазерними променями [9]. Існує думка, що стимулююча дія лазерних випромінювань можлива лише при обробці насіння з низьким або середнім життєвим потенціалом [6]. Залишилась невиясненою можливість стимулювати ростові процеси у насіння з високим життєвим потенціало. Тому спочатку оцінено реакцію насіння хрінниці посівної на лазерне проміння різної довжини хвилі та енергії випромінювання.

У табл. 1 показана лабораторна схожість насіння хрінниці посівної після його опромінення гелій-неоновим лазерним промінням різної довжини хвилі. Неперервне лазерне випромінювання (l = 1,15 та 3,39 мк) у межах Е = 0,34 – 1,38 Дж слабо стимулювало схожість насіння (різниця недостовірна). Вирішено в подальших дослідженнях використовувати лише лазерне проміння з довжиною хвилі l = 0,63 мк. Але результати досліджень оптимальних режимів лазерного опромінення за лабораторною схожістю та швидкістю проростання насіння у рослинних об’єктах з високим життєвим потенціалом виявилися ненадійними. Тому в наступній серії дослідів одночасно з традиційною оцінкою життєздатності насіння ми впродовж 2 діб через кожні 2 години визначали за допомогою окуляр-мікрометра довжину коріння й розраховували швидкість росту корінців крес-салату за величиною тангенса кута нахилу дотичної кінетичної кривої росту корення рослин до осі абсцис.

Таблиця 2

Динаміка росту коріння крес-салату за різних режимів лазерного опромінення

Режим,	Довжина коріння (мк) ½ Середня через годин ½ швидкість
доза, Дж	17	25	40	47	росту, мк/год
Контроль	6,5	46,5	305	350	5,57 ± 0,4
Непер. 0,3	10	58,6	340	420	11,3 ± 0,8
Непер. 0,6	8,4	60,1	329	448	12,8 ± 0,4
Скан.0,023	10	50,3	324	415	12,8 ± 0,9
Скан.0,061	12	70,6	376	455	12,8 ± 0,6

Визначення швидкості росту корінців показало (табл. 2), що в усіх випадках опроміненого насіння вона вища порівняно з неопроміненим контролем. Максимальна швидкість росту корінців спостерігалась наприкінці першої доби пророщування насіння. Водночас швидкість росту корінців у опроміненого крес-салату коливалась у межах 28,6 мк/год, а у неопромінених – 9,5 мк/год. Надалі швидкість росту корінців зменшилась відповідно в середньому до 12,8 і 5,6 мк/год і залишалась постійною до кінця досліду. Отже, лазерне опромінення насіння підвищує швидкість росту коренів на початкових етапах пророщування приблизно в 2 рази, що не може не відобразитись на формуванні рослинного організму в пізніші періоди вегетації. Про це свідчать дані про ґрунтову схожість насіння крес-салату і проведені феноспостереження за розвитком опромінених і неопромінених рослин у процесі вегетації ( табл. 3).

Зясувалось, наприклад, що вже через 4 дні після посіву ґрунтова схожість опроміненого насіння була на 20 % вищою, ніж у неопроміненому контролі. Проведена нами біометрія рослин показала, що вже через 2 тижні після початку досліду опромінені рослини (Е = 0,6 Дж) переважають за висотою контрольну групу майже на 5 см. У кінці вегетації цей ефект перевищення в рості опромінених рослин над неопроміненими залишається ще вираженішим .

Таблиця 3

Вплив лазерного випромінювання на ґрунтову схожість насіння крес-салату

Доза	Зійшло насіння %, через діб ½ Схожість
Дж	4	5	6	7	9	%
Контр.	58,0	70,5	72,5	74,0	74,0	74,0 ± 4,5
0,023	72,5	73,5	76,5	78,5	79,5	79,3 ± 7,0
0,061	84,0	84,0	87,0	88,0	88,3	88,4 ± 3,0
0,38	66,5	78,5	80,0	82,5	82,5	82,5 ± 2,5

Найкращі показники стимуляції росту хрінниці посівної одержано після опромінення насіння сканованим промінням упродовж 120 с (0,046 Дж), а за неперервного режиму – відповідно 10 хв (0,6 Дж). Ці дані були використані нами в дальших дослідженнях.

Важливу роль у реакціях рослин на різні фактори навколишнього середовища відіграє зміна інтенсивності перекисного окислення (ПОЛ). Основним субстратом пероксидації в клітині є ненасичені жирні кислоти ліпідів мембран [1]. Багато зовнішніх впливів призводить до індукції ПОЛ з подальшим розвитком окислювальної деструкції аж до загибелі клітини. При цьому стійкість рослин до таких впливів передусім визначається станом їх антиоксидантних систем, головна функція яких полягає в інгібуванні стресорної активації пероксидації, через пригнічення утворення вільних радикалів, що веде до блокування процесів ПОЛ. У наших експериментах прооксидант H₂O₂ у концентраціях 0,1%, 02% та 0.3% стимулював схожість насіння та ріст корінців хрінниці посівної на початкових етапах і пригнічував ростові процеси у віддаленіщі періоди формування рослинного організму. Ці спостереження підтверджуються даними про стимуляцiю схожості насіння пiд впливом рiзних за своєю хiмiчною природою сполук, таких, як Н₂О₂, органiчнi розчинники й анестетики [2].

Щоб переконатися у тому, що дія перекисі водню на схожість насіння та ріст корінців зумовлена саме впливом на реакції ПОЛ у клітинах, до інкубаційного середовища, в якому пророщували насіння, вносили Н₂О₂ та інгібітори перекисного окислення – аскорбінову кислоту та a-токоферол.

На рис.1 показано інгібуючу дію ТФ на ПОЛ за умов лазерної стимуляції росту коріння крес-салату, виражену в відсотках від контролю. Біометричний аналіз паростків хрінниці посівної, що росли в умовах лазерної стимуляції росту (скановане лазерне випромінювання, Е = 0,046 Дж) на середовищі з ТФ, показав, що різні концентрації антиоксиданту неодинаково впливають на ріст досліджуваних рослин. Найчіткіше ефект стимулювання росту коріння хрінниці посівної спостерігався після застосування a-токоферу в концентрації 2´10^–2 М. Цей стимулюючий ефект пояснюється підсиленням процесу проліферації клітин, унаслідок сповільнення реакцій ПОЛ. У випадку, де досліджувалася дія неперервного лазерного світла на динаміку росту корінців хрінниці посівної при її вирощуванні на середовищі з a-токоферолом зясувалося, що корінці опромінених рослин були довшими в середньому втричі, ніж у контрольних рослин. Опромінення рослин сканованими лазерними променями на цьому ж середовищі стимулювало збільшення довжини корінців майже в двічі порівняно з довжиною корінців у контролi. Ці дані вказують на те, що комбінований вплив лазерних променів з a-токоферолом стимулює ростові процеси на початкових етапах формування вегетативних органів крес–салату при передпосівному опроміненні насіння лише в обмеженому діапазоні доз та концентрацій антиоксиданту і залежить від режиму опромінення. Через 48 год після додавання в середовище перекисі водню в концентрації 0,3% ріст коріння поступово сповільнився. Дія прооксиданту здійснюється шляхом підсилення швидкості виникнення окисних радикалів, завдяки чого посилюються реакції ПОЛ і в мембрані нагромаджуються його продукти, змінюється жирнокислотний склад ліпідів і відповідно в’язкість ліпідної фази, що, в свою чергу, впливає на активність низки ферментів, а відповідно й на протікання метаболічних та морфофізіологічних процесів у клітинах рослин. За нормальних умов надлишок Н₂О₂ елімінується з організму, внаслідок активації ферментів класу оксидоредуктаз, зокрема каталази і пероксидази. До такої дії залучаються і антиоксиданти. В наших експериментах токоферол тільки на 5 – 10 % зменшував вплив 3 % розчину перекисі водню . Можливо рослинний організм за цих умов зазнав перенасичення окисними радикалами, внаслідок чого його функціонування гальмувалося. Це питання вимагає подальших досліджень.

Аскорбінова кислота, як антиоксидант, також захищає ліпіди і мембрани від окисного пошкодження шляхом ефективного зв’язування радикалів, що ініціюють ПОЛ. У наших дослідах АК у концентрації 0,25% також стимулювала проростання насіння (рис. 2) і зменшувала інгібуючий вплив прооксиданту у концентрації 0,1%. Механізм знешкодження Н₂О₂ можна представити так: перекис водню проникаючи в рослинну клітину викликає появу пероксид – радикалів, підвищена концентрація яких активує аскорбінову кислоту. Антиоксидантна роль АК ґрунтується на її реакції з водорозчинними пероксид – радикалами з утворенням аскорбіл – радикалів, завдяки чого пероксидні радикали інактивуються. В наших дослідах лазерна стимуляція ростових процесів хрінниці посівної за рахунок АК зросла на 15 – 20 %. Очевидно, антиоксидантні властивості АК посилюються в умовах лазерної фотоактивації рослинних організмів.

ЛВ+AK

AK

ЛВ+H₂O₂+AK

ЛВ+H₂O₂

ЛВ

H₂O₂

години

Рис.1. Вплив аскорбінової кислоти на інгібуючу дію перекису водню в умовах лазерної стимуляції росту коріння хрінниці посівної. ЛВ –неперервне лазерне випромінювання 0,6 Дж; AK – 0,25 % розчин аскорбінової кислоти; H₂O₂ – 0,1 % розчин перекису водню

ЛВ+ТФ

ЛВ

ЛВ+ ТФ+H₂O₂

H₂O₂ ЛВ+H₂O₂

години

Рис 2. Вплив a-токоферолу на інгібуючу дію перекису водню в умовах лазерної стимуляції росту коріння крес-салату. ЛВ – скановане лазерне випромінювання 0,046 Дж; ТФ – a-токоферол; H₂O₂ – 0,3 % розчин перекису водню

Одержані результати свідчать про те, що реакції ПОЛ детермінують лазерну стимуляцію схожості та проростання насіння хрінниці посівної. Не виключена можливість перспективного застосування оптичних випромінювань у комбінації з антиоксидантами в різних галузях сільського господарства, оскільки комбінований вплив досліджуваних факторів підвищує насіннєві показники, ріст і подальший розвиток рослин. Саме така комбінація факторів, може бути використана в основі нових методичних рекомендацій для підвищення продуктивності та врожайності сількогосподарських культур через активацію їх метаболічних та морфофізіологічних процесів. З вищесказаного можна зробити висновок, що механізм лазерної біостимуляції ростових процесів пов’язаний з процесами ПОЛ. Вплив лазерного опромінення, очевидно, здійснюється за участю фітохромної системи червоного – далекого червоного світла. При дії лазерних променів фітохром Фч активується у стабільнішу форму Фдч, що запускає процес накльовування насіння і швидкого його переходу в стан активного метаболізму. Водночас ця фітохромна система рослинного організму взаємодіє з процесами ПОЛ і ця взаємодія здійснюється через фітохром – залежний фермент – ліпоксигеназу, який виступає в ролі однієї з оксидаз NADPH – залежного ініціювання ПОЛ. Все це вказує на участь реакцій ПОЛ у регуляції стану фізіологічного спокою насіння та його проростання на початкових етапах онтогенезу хрінниці посівної. Досі ще невідома роль такого універсального координатора внутрішньоклітинних процесів, як іони Ca²⁺ у регуляції реакцій ПОЛ.

____________________

1. Барабой В. А., Брехман И. И., Голотин В. Г., Кудряшов Ю. Б. Перекисное окисление и стресс . Санкт-Петербург, 1992.

2. Величко Э.Б. и др. “Эффективность обработки семян риса H₂O₂ // Селекция и семеноводство. 1979. №6. С. 39–40.

3. Дмитриев Л. Ф. Роль токоферола в функционировании липидно радикальных циклов и превращении энергии в мембранах // Биохимия. 1998. Т. 107. С. 1147–1150.

4. Инюшин В. М. Лазер – стимулятор. Алма-Ата, 1977.

5. Инюшин В.М. Луч лазера и урожайность. Алма-Ата, 1981.

6. Китлаев Б. Н. Теоретические и прикладные аспекты фотоэлектрических воздействий на семена и растения // Механизация и электриф. с/х растений. М., 1982. №4. С. 21–26.

7. Мордерер Є.Ю., Гродзінський Д.М. Реакції перекисного окислення ліпідів та регуляція стану фізіологічного спокою насіння // Укр. ботан. журн. 1988. Т.45. №6. С. 84–90

8. Мордерер Є.Ю., Гродзінський Д.М. Вплив прооксидантів та інгібіторів перекисного окислення на схожість насіння Lactuca sativa L від температури // Укр. ботан. журн. 1992. Т.49. №6. С. 63–65

9. Посудин Ю.И. Лазерная фотобиология. К., 1989.

10. Скварко К.О. Лазерна фотоактивація насіння. Перспективи, рекомендації. Львів, 1994.

11. Скварко К.О. Світлолазерна фотоактивація рододендронів. Львів. 1996. Деп. в УкрІНТЕІ. 08.09.1997. №526–І : 97.

12. Briviba K., Sies H. Natural antioxidant in human health and disease // Ed. Frei B. Academic Press, San Diego, New York. 1994. P. 107–128.